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文檔簡介
1、背景:L-谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì),主要位于大腦皮層和海馬等部位。當(dāng)谷氨酸病理性升高時,其作為一種神經(jīng)毒素可以誘導(dǎo)嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷,谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的過度激活或谷氨酸的過度刺激都將引起細(xì)胞的死亡,這種病理過程被稱為谷氨酸的神經(jīng)毒性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸的神經(jīng)毒性伴隨著線粒體膜電位的下降以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的過度生成,這些線粒體功能障礙指標(biāo)提示谷氨酸的神經(jīng)毒性與線粒體功能可能存在聯(lián)系。
線粒體是一種高度動態(tài)
2、的細(xì)胞器,通過不斷的分裂融合保持線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)。最近研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)被破壞時會影響到線粒體正常的功能,趨向于分裂導(dǎo)致線粒體碎片產(chǎn)生,線粒體縮短;相反趨向于融合時導(dǎo)致線粒體變長。線粒體的融合/分裂運(yùn)動主要被一系列線粒體融合/分裂蛋白調(diào)控。這些蛋白主要包括了:分裂蛋白:.dynamin-like protein1(DLP1,也叫Drp1),以及它的作用因子包括Fis1,Mff, MiD49 and MiD51;融合蛋白:Mitofusi
3、n1(Mfn1),Mitofusin2(Mfn2)以及optic atrophy protein1(OPA1)。這些蛋白除了調(diào)控線粒體的形態(tài),也在線粒體功能正常運(yùn)行的各個環(huán)節(jié)上有重要的作用。因而順理成章,目前已有很多研究表明線粒體的分裂/融合穩(wěn)態(tài)的改變可以導(dǎo)致線粒體的功能障礙,引起相關(guān)神經(jīng)疾病。
目的:通過對大鼠原代神經(jīng)細(xì)胞,谷氨酸灌注小鼠模型,轉(zhuǎn)基因小鼠,人體標(biāo)本的研究,探索谷氨酸的神經(jīng)毒性信號通路,然后找到并證實介導(dǎo)谷氨酸
4、神經(jīng)毒性的關(guān)鍵蛋白,最終在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞外,動物模型以及人體上闡明并證明谷氨酸的神經(jīng)毒性機(jī)理以及信號通路。
方法和材料:抗體、質(zhì)粒、化學(xué)試劑及測量方法
購買或獲得質(zhì)粒:MitoDsRed2(Clontech公司,Mountain View, CA),Case12construct(來自Evrogen公司,Moscow, Russia),GFP-Cre(來自Addgene公司,Cambridge MA)以及GFP/Myc
5、-tagged Mfn2(斯坦福大學(xué)提供).通過neomycin/kanamycin抑制基因在MitoDsRed2序列中利用核定位信號(GFP-Cre質(zhì)粒中的NLS-Cre)增加Cre序列成功構(gòu)建MitoDsRed2/Cre雙啟動子質(zhì)粒.克隆mitoDsRed2并導(dǎo)入pLVX-Puro(Clontech公司,Mountain View, CA)質(zhì)粒用NLS-Cre替代puromycin抑制基因成功構(gòu)建MitoDsRed2/Cre雙啟動子
6、慢病毒。利用第三代慢病毒包裝盒(包裝系統(tǒng):pMDLg/pRRE和pRSV-Rev;包裹質(zhì)粒:Addgene公司,Cambridge MA的pMD2.G)成功制備慢病毒。得到數(shù)據(jù)后,裂解細(xì)胞并測定細(xì)胞總蛋白,氧消耗量根據(jù)總蛋白不同進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化量化。通過Cytotoxicity Detection試劑盒(LDH; Roche公司,Nutley,NJ)或CellProliferation試劑盒(MTT法;Roche公司,Nutley,NJ)測定
7、細(xì)胞死亡和生存率。通過細(xì)胞普羅匹定碘化物測定神經(jīng)細(xì)胞存活率。帶有普羅匹定碘化物陽性細(xì)胞核或者可見的細(xì)胞核碎片或神經(jīng)突碎片的神經(jīng)細(xì)胞計作壞死神經(jīng)細(xì)胞,而普羅匹定碘化物陰性的細(xì)胞核并且具有完整的神經(jīng)細(xì)胞核輪廓或者神經(jīng)突的神經(jīng)元計為存貨細(xì)胞。
原代神經(jīng)細(xì)胞的分離
原代神經(jīng)細(xì)胞分離(應(yīng)用大鼠腦組織或胚胎或)利用鼠Thy-1.2基因表達(dá)盒將Thy1-Mfn2注射入C57BL/6N鼠受精卵內(nèi)成功構(gòu)建mfn2過表達(dá)小鼠。根據(jù)美國動
8、物保健和使用委員會(IACUC)制定的指南處理適宜懷孕時間的Sprague-Dawley母鼠(大鼠)(Harlan or Charles River)或者C57BL/6N母鼠(小鼠),成功從E13-15母鼠(大鼠)/E12-14母鼠(小鼠)胚胎中分離原代運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞,從E18母鼠(大鼠)胚胎中分離原代神經(jīng)細(xì)胞。
線粒體的純化及蛋白質(zhì)印記分析
在細(xì)胞中加入1xLysis buffer(Cell Signaling公司,
9、Danvers,MA)和1 mMPMSF(Sigma公司,St.Louis,MO)以及蛋白酶抑制劑(Sigma公司,St.Louis,MO)提取總蛋白.用SDS-PAGE溶解同樣體積的總蛋白然后轉(zhuǎn)到Immobilon-P(Millipore公司,Billerica, MA)膜.10%的脫脂牛奶封閉后,用一抗二抗進(jìn)行孵育,蛋白膜用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millip
10、ore公司,Billerica,MA)顯影劑進(jìn)行顯影曝光.
谷氨酸灌注小鼠動物模型的建立
所有小鼠的手術(shù)及手術(shù)過程嚴(yán)格按照美國NIH指南進(jìn)行,并且依據(jù)動物護(hù)理及使用協(xié)會IACUC的規(guī)定進(jìn)行操作。迷你滲透性泵(2001模型,Alzet公司,Cupertino,CA;液體泵速率1μl/小時)接入2cm的大腦注入管(腦注入盒,Alzet公司,Cupertino,CA)并在其中分別泵入模擬腦脊液aCSF(成分:124 mM
11、NaCl,25 mMNaHCO3,10 mM D-glucose,2.5 mM KCl,1 mM MgCl2,2 mM CaCl2和1mMNaH2PO4,并用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4)或者aCSF溶解10mM谷氨酸。并依據(jù)使用說明在37度環(huán)境下通宵注射藥物。
小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測成功構(gòu)建免疫熒光小鼠,以便于利用線粒體特征蛋白Tom20和VDAC1更好的觀察運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)。簡要介紹過程
12、如下:用蒸餾水沖洗3次組織切片放置于1x抗原decloaker(Biocare公司,Concord,CA)試劑中。在22psi氣壓下加熱至125度10秒,然后在0 psi氣壓下冷卻至90度30秒,利用Biocare公司的Decloaking Chamber高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后用10%的羊血清(NGS,St.Louis,MO)對切片封閉30分鐘,并在1%羊血清的PBS中孵育一抗過夜。第二天PBS沖洗3次后用10%的羊血清孵育10分鐘,
13、然后加入熒光顯影二抗(Invitrogen公司,Grand Island,NY)(1∶300)室溫避光孵育2小時,最后切片用PBS清洗,用DAPI染色,再次用PBS洗3次,加入熒光介質(zhì)油(Southern Biotech公司,Birmingham,AL)。
小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的電鏡檢測
EM固定液(the quarter strength Karnovsky-1.25% DMSO mixture)通過心臟灌注法輸入小鼠
14、體內(nèi)5分鐘后迅速取出脊髓并放置于EM固定液中室溫15分鐘,更換新鮮EM固定液繼續(xù)固定2小時。PBS清洗后組織塊用1% osmium-1.25%ferrocyanide mixture室溫固定2小時。組織切片清洗后浸泡在酸化的0.5%uranylacetate溶液中.再次沖洗后組織塊在濃度依次上升的酒精中脫水,最后包裹在Poly/Bed812樹脂中(Polysciences公司,Warrington,PA).較薄的切片隨后用2%酸化ura
15、nyl acetate染色并用Gatan single tilt,Gatan US40004kx4k CCD電鏡觀察(Gatan公司,Pleasanton, CA)。
體外鈣蛋白酶切割實驗
100ug純化線粒體蛋白以及1ug重組Mfn2蛋白(Origene公司,Rockville,MD)分別與人紅細(xì)胞純化u-calpain(calpain-1)(Biovision公司,Milpitas,CA)蛋白在30度孵育30分鐘
16、。以calpain-Ⅰ提前與PMSF或者calpeptin30度孵育5分鐘為抑制組。最后添加含有62.5 mM Tris-HCl,4% SDS,10% glycerol,50 mM DTT和0.1% bromophenol blue(pH6.8)的SDS樣本液停止反應(yīng).樣本經(jīng)過100度10分鐘變性煮沸,加入1/6的反應(yīng)蛋白量進(jìn)行免疫印跡分析。
結(jié)果:1.在神經(jīng)細(xì)胞中谷氨酸可導(dǎo)致線粒體破裂
2.在神經(jīng)細(xì)胞中,Mfn2的
17、缺失可導(dǎo)致線粒體和神經(jīng)細(xì)胞的毒性
3.細(xì)胞實驗:Mfn2過表達(dá)可以阻斷谷氨酸介導(dǎo)的線粒體功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞死亡
4.動物實驗:Mfn2過表達(dá)可以保護(hù)線粒體和神經(jīng)細(xì)胞免于谷氨酸所引起的細(xì)胞毒性
5.谷氨酸作用于神經(jīng)細(xì)胞后通過激活Calpain來實現(xiàn)對mfn2的剪切
6.在人體標(biāo)本中驗證了谷氨酸所介導(dǎo)的calpain的激活,mfn2的剪切,以及線粒體的破裂
結(jié)論:谷氨酸介導(dǎo)calpain的激
18、活剪切mfn2后,可引起線粒體功能障礙及運(yùn)動障礙,最終出現(xiàn)谷氨酸的神經(jīng)毒性并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。通過阻斷mfn2的剪切可以在細(xì)胞模型及動物模型上阻斷谷氨酸所介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。創(chuàng)新性及意義:谷氨酸的神經(jīng)毒性作用廣泛存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中包括腦出血,卒中,腦腫瘤,中樞系統(tǒng)感染,并且與相關(guān)疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。本實驗從體內(nèi)到體外,從細(xì)胞模型到動物模型再到人體模型均證實了谷氨酸所介導(dǎo)的mfn2剪切所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性,意義重大,相關(guān)信號通路將可能成為未
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