機(jī)械拉伸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移行為的調(diào)節(jié)及其相關(guān)分子機(jī)理研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有增殖和多向分化潛能的特殊細(xì)胞，在特定環(huán)境條件下，MSCs可增殖并定向分化為多種細(xì)胞。同時(shí)，MSCs具有趨化特性，可以響應(yīng)炎癥或組織損傷(包括腫瘤組織)，進(jìn)行動(dòng)員、遷移。MSCs在機(jī)體組織損傷修復(fù)和再生中具有重要作用，是臨床細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，也是目前應(yīng)用最多的干細(xì)胞類型。
　　 機(jī)體中的細(xì)胞和組織處于復(fù)雜的

2、力學(xué)微環(huán)境中，MSCs在移出骨髓進(jìn)入外周血循環(huán)的過程中，受到血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪應(yīng)力和張應(yīng)變的影響。力學(xué)因素可調(diào)節(jié)活細(xì)胞的生理、病理過程，有關(guān)機(jī)械刺激對MSCs增殖、表型和分化影響的報(bào)道比較多，相關(guān)的分子機(jī)理在深入研究中。但到目前為止，人們對影響MSCs遷移行為的力學(xué)因素及其分子機(jī)理還知之甚少。本文試圖揭示機(jī)械拉伸對大鼠MSCs(ratMSCs，rMSCs)遷移行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)理。
　　 本文選用原代分離培養(yǎng)的rMSCs，運(yùn)

3、用單軸拉伸加載裝置對培養(yǎng)在彈性硅膠膜上的rMSCs施加不同條件(頻率1Hz，形變量5％～15％，拉伸時(shí)間4～12 h)的機(jī)械拉伸。采用Transwell法和劃痕法評價(jià)拉伸前后細(xì)胞遷移能力的變化，基于明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-9(Matrix metalloproteinase-2，-9)表達(dá)的變化。用MMPs抑制劑GM6001抑制拉伸刺激對rMSCs MMP-2和MMP-9表達(dá)的激活，考察抑制MMP-2和MMP-9對拉伸促進(jìn)r

4、MSCs的遷移的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 ①rMSCs的原代分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)采用Percoll密度梯度離心法，結(jié)合rMSCs的貼壁特性，體外分離、培養(yǎng)rMSCs，rMSCs形狀一致，呈長梭樣、漩渦狀分布。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，rMSCs原代細(xì)胞表達(dá)CD44和CD90，不表達(dá)CD34，與rMSCs表面標(biāo)記抗原一般規(guī)律一致，說明分離培養(yǎng)的rMSCs表型均一，符合rMSCs特點(diǎn)。
　　 ②機(jī)械拉伸加載

5、對rMSCs遷移行為的影響
　　 將細(xì)胞培養(yǎng)在彈性硅膠膜上，采用自制的細(xì)胞拉伸加載裝置拉伸硅膠膜，對細(xì)胞實(shí)施加載。運(yùn)用Transwell法檢測細(xì)胞遷移，研究發(fā)現(xiàn)頻率1 Hz、形變量10％、拉伸時(shí)間8 h加載條件促進(jìn)rMSCs的遷移效果較明顯。劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明，頻率1Hz、形變量10％、拉伸時(shí)間8 h機(jī)械刺激對rMSCs遷移能力有促進(jìn)作用。
　　 ③MMP-2和MMP-9參與機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的rMSCs遷移
　　 采

6、用明膠酶譜法檢測頻率1Hz、形變量10％、拉伸時(shí)間8 h加載條件下MMP-2和MMP-9活性變化，發(fā)現(xiàn)拉伸加載組，rMSCs中MMP-2和MMP-9活性分別增加到對照組的235％和248％。
　　 在機(jī)械拉伸前加入MMP-2和MMP-9抑制劑GM6001，檢測細(xì)胞遷移和MMP-2和MMP-9表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25μM GM6001顯著抑制機(jī)械刺激誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9分泌增加，同時(shí)機(jī)械刺激誘導(dǎo)的rMSCs遷移受到抑制。結(jié)果