肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的影響及其分子機(jī)理.pdf

1、肝癌是全球第六位常見惡性腫瘤，該疾病不僅具有高致死率，近年來發(fā)病率也呈上升趨勢，對肝癌的預(yù)防和治療及其機(jī)理研究一直是各國科學(xué)家探索的焦點(diǎn)?，F(xiàn)在廣泛使用的治療手段如外科切除術(shù)、肝移植等雖然對肝癌的治療有一些效果，但這些治療方法存在一些限制，如對患者創(chuàng)傷巨大、可能導(dǎo)致免疫紊亂、適用人群少等。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有向損傷組織或腫瘤細(xì)胞靶向遷移的能力，這一特性吸引了眾

2、多學(xué)者的關(guān)注。MSCs不僅具有增殖能力較強(qiáng)、免疫相容性良好、來源廣泛和不涉及倫理問題等基本特征，而且具有靶向遷移的特性。因此，MSCs極可能發(fā)展成為一種具有靶向治療腫瘤細(xì)胞能力的抗瘤工具。
　　MSCs的自我更新和分化潛能等生物學(xué)行為高度依賴于所處的微環(huán)境。MSCs遷移到腫瘤細(xì)胞后會參與重塑腫瘤微環(huán)境進(jìn)而影響到腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，該微環(huán)境也能反饋調(diào)節(jié)MSCs的生物學(xué)特性。微環(huán)境的擾動可能導(dǎo)致MSCs過度增殖或惡性生長，甚至還可能

3、發(fā)生癌變。但在該過程中，腫瘤細(xì)胞與MSCs相互作用的機(jī)制并不清楚，MSCs在重塑微環(huán)境中的生物學(xué)行為變化受到哪些受體或信號調(diào)控及其機(jī)制也鮮有研究。因此，本文旨在探索 MSCs在腫瘤微環(huán)境作用下生物學(xué)行為的變化，并對其相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行探討。該研究工作的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.大鼠MSCs（rat MSCs，rMSCs）的原代分離培養(yǎng)
　　通過淋巴細(xì)胞分離液（Percoll）密度梯度離心法結(jié)合差時貼壁法分離rMSCs。結(jié)果

4、顯示，從大鼠骨髓腔分離得到的rMSCs體外培養(yǎng)24h即可貼壁，7天左右長出漩渦狀集落，記為P0代。傳代一次后記為P1代，以此類推。此法分離得到的rMSCs具有漩渦狀分布特征，細(xì)胞形態(tài)呈梭型并趨于一致。該細(xì)胞在生長過程中能完全鋪展，無疊層生長現(xiàn)象。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測了細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示G0/G1期細(xì)胞為94.23±0.84％，G2/M期細(xì)胞為4.44±1.13%，S期細(xì)胞為1.34±0.30%，說明大部分細(xì)胞處于靜止期，符合

5、干細(xì)胞周期分布的基本特征。
　　2.大鼠肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基通過SDF-1/CXCR4-ERK1/2信號促rMSCs遷移
　　通過Transwell法體外檢測了大鼠肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（Conditioned medium from hepatocellular carcinoma cells，HCC-CM）對rMSCs遷移的影響。結(jié)果顯示，HCC-CM顯著促進(jìn) rMSCs遷移，而大鼠正常肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基（Conditioned

6、 medium from rat normal hepatocyte cells,NCM）則對rMSCs的遷移行為沒有明顯影響；HCC-CM促rMSCs遷移的過程中伴隨著rMSCs SDF-1基因及其受體CXCR4基因的表達(dá)上調(diào)，Western blot進(jìn)一步證實(shí)了rMSCs CXCR4蛋白水平表達(dá)的上調(diào)（p<0.05）。rMSCs在HCC-CM刺激下，從15min至2h均出現(xiàn)ERK1/2磷酸化顯著上調(diào)，且在15 min時達(dá)到峰值（p<

7、0.01），之后略有下降，但均顯著高于對照組。MEK/ERK1/2抑制劑PD98059消除了HCC-CM對ERK1/2的激活，同時完全阻斷了HCC-CM促rMSCs的遷移，表明ERK1/2信號分子介導(dǎo)了HCC-CM促rMSCs遷移。CXCR4抑制劑AMD3100顯著抑制HCC-CM誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，同時抑制HCC-CM促rMSCs遷移。這些結(jié)果提示，HCC-CM促進(jìn)rMSCs遷移可能是通過SDF-1/CXCR4-ERK1/2信號

8、通路實(shí)現(xiàn)的。
　　3. HCC-CM促進(jìn)rMSCs增殖及其分子機(jī)理
　　本文通過MTT法、EdU細(xì)胞增殖檢測和細(xì)胞周期檢測等方法考察了HCC-CM對rMSCs增殖的作用。結(jié)果顯示，HCC-CM明顯促進(jìn)了rMSCs增殖，同時發(fā)現(xiàn)NCM也能促進(jìn)rMSCs增殖，但不及HCC-CM作用顯著。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，HCC-CM在15min至2 h均能使rMSCs ERK1/2磷酸化顯著上調(diào)，15min時與對照組比較即有顯著

9、性差異（p<0.01），之后略有下降，但均顯著高于對照組。PD98059可完全消除HCC-CM誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化并同時阻斷HCC-CM誘導(dǎo)的rMSCs增殖，提示ERK1/2是HCC-CM促rMSCs增殖的主要信號介導(dǎo)分子。本文發(fā)現(xiàn)，HCC-CM促rMSCs增殖過程中SDF-1基因表達(dá)上調(diào)，但CXCR4在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)與對照組無明顯差異。盡管如此，CXCR4抑制劑AMD3100部分抑制ERK1/2磷酸化，并部分抑制了H

10、CC-CM促rMSCs增殖。這些結(jié)果表明HCC-CM促進(jìn)rMSCs增殖是通過ERK1/2信號通路完成的，且該信號受到CXCR4的部分調(diào)控。我們還對細(xì)胞核內(nèi)與增殖密切相關(guān)的NF-κB信號進(jìn)行了初探，結(jié)果顯示NF-κB抑制劑PDTC顯著抑制HCC-CM誘導(dǎo)的rMSCs增殖行為，提示NF-κB可能是參與HCC-CM促增殖行為的核內(nèi)信號分子。
　　本文的研究結(jié)果表明，HCC-CM顯著促進(jìn)rMSCs的遷移和增殖，這個過程可能受到SDF-1/