交鏈孢菌cDNA文庫構(gòu)建及激活蛋白基因克隆與融合表達(dá).pdf

1、激活蛋白是從多種真菌中篩選、分離、純化出的一系列新型蛋白質(zhì)。對(duì)植物煙草花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病等多種病毒病和蚜蟲都有較好控制效果，并能提高作物的抗旱能力和提高作物產(chǎn)量，具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。激活蛋白基因的克隆是構(gòu)建高效工程菌菌株、研究作用機(jī)理、分析結(jié)構(gòu)與功能域研究的重要基礎(chǔ)，本文以激活蛋白產(chǎn)生菌—交鏈孢菌為材料，用基于λ噬菌體特異位點(diǎn)重組反應(yīng)構(gòu)建定向cDNA文庫的Gateway(R)新技術(shù)，首次成功構(gòu)建交鏈孢菌cDNA入門文庫和表達(dá)

2、文庫，進(jìn)行基因表達(dá)與純化研究，為交鏈孢菌的分子生物學(xué)研究提供了良好的遺傳背景，同時(shí)為激活蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。對(duì)揭示激活蛋白的作用機(jī)理以及蛋白藥物的分子設(shè)計(jì)具有重要意義。 1.利用Gateway(R)技術(shù)，首次成功構(gòu)建了交鏈孢菌cDNA入門文庫和表達(dá)文庫。構(gòu)建的cDNA入門文庫經(jīng)檢測，入門文庫的滴度達(dá)到6×106，文庫總?cè)萘繛?.6×107，其陽性克性率為100％，平均插入片段大小大約為1.53Kb。通過LR重組

3、把入門文庫轉(zhuǎn)換為表達(dá)文庫。表達(dá)文庫的滴度為1.53×106，文庫總?cè)萘繛?.2×106，其陽性克性率為100％，平均插入片段大小大約為1.62Kb，為用激活蛋白抗體篩選文庫克隆其編碼基因提供基礎(chǔ)。 2.成功地利用免疫學(xué)方法篩選Alternariasp.菌株cDNA表達(dá)文庫，篩選和克隆到一段包括起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的882bp的完整編碼序列，該核酸序列推測的氨基酸序列與已有的35kD蛋白的質(zhì)譜測定所得肽段序列相比有較高的相似