極細(xì)鏈格孢菌激活蛋白PeaT1結(jié)構(gòu)域分析與功能研究.pdf

1、PeaT1是一種從極細(xì)鏈格孢菌中分離純化的激活蛋白，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗性的作用。為了闡明PeaT1多效機(jī)制是否取決于分子內(nèi)部可能存在的功能域，本文分析了PeaT1的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了PeaT1及其三個(gè)缺失突變體表達(dá)載體，分別誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，以期分析PeaT1結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渖飳W(xué)效應(yīng)和蛋白特性的影響。主要研究結(jié)果如下： 1.peaT1及其缺失突變體表達(dá)載體的構(gòu)建 通過(guò)提取極細(xì)鏈格孢菌的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)而擴(kuò)

2、增獲得了peaT1基因。利用生物信息學(xué)對(duì)PeaT1蛋白進(jìn)行了初步分析，得知其有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：NAC(49-108位AA)和UBA/TS-N(162-206位AA)。用PCR方法擴(kuò)增了3個(gè)缺失基因片段：peaT1-△CD99、peaT1-△ND49和peaT1-△ND108，將這三個(gè)片段分別與pET-28a連接構(gòu)建了三個(gè)缺失突變體的融合表達(dá)載體。 2.PeaT1及其三個(gè)缺失突變體蛋白的表達(dá)和純化 將peaT1和三個(gè)缺失基因片

3、段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，獲得了PeaT1及其缺失突變體蛋白。用蛋白純化系統(tǒng)(AKTAExplorer10.0)對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行His·Tag親和層析和脫鹽處理，通過(guò)生物質(zhì)譜技術(shù)獲得了PeaT1的標(biāo)準(zhǔn)分子量為26.319kD，與理論蛋白的分子量26.259kD相符。 3.PeaT1及其突變體蛋白的功能比較與分析 三個(gè)缺失突變體與PeaT1蛋白一樣，對(duì)小麥生長(zhǎng)和抗病性都有顯著

4、的促進(jìn)作用，而各表達(dá)蛋白之間的生物活性沒(méi)有顯著差異。結(jié)合生物信息學(xué)分析和前人研究結(jié)果推測(cè)：PeaT1蛋白NAC保守區(qū)域的作用機(jī)理，可能是其充當(dāng)分子伴侶的作用，促進(jìn)蛋白的正確折疊，以及其通過(guò)OB結(jié)合域的方式與TBP等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)錄共激發(fā)子的作用促進(jìn)下游某些基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高抗性；UBA/TS-N保守區(qū)域，與翻譯延伸因子EF1B(EF-Ts)相似，可能更多的是擔(dān)當(dāng)一種翻譯共激發(fā)子來(lái)誘導(dǎo)植株生長(zhǎng)和增強(qiáng)植物抗逆。由此推測(cè)，P

5、eaT1的2個(gè)結(jié)構(gòu)域可能具有獨(dú)立或類似的生物功能。 4.穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)研究 PeaT1及其突變體蛋白誘導(dǎo)日本晴蛋白的差異表達(dá)分別用15N和14N培養(yǎng)基培養(yǎng)日本晴幼苗，在相同的生長(zhǎng)環(huán)境下，用PeaT1及其突變體蛋白處理15N標(biāo)記的水稻(14N標(biāo)記水稻作為對(duì)照)。通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定獲得了近百種上調(diào)表達(dá)的蛋白，確定了PeaT1和3個(gè)缺失基因片段編碼的蛋白均能引起水稻日本晴蛋白的差異表達(dá)。通過(guò)對(duì)33種差異蛋白的功能分析，得知它們與

6、植物葉綠體光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ和翻譯起始因子相關(guān)，為激活蛋白作用機(jī)理的研究提供了理論基礎(chǔ)。 5.PeaT1及其三個(gè)突變體蛋白的熱穩(wěn)定性分析 對(duì)表達(dá)的PeaT1和三個(gè)突變體蛋白的耐熱性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示它們都具有很好的熱穩(wěn)定性。通過(guò)氨基酸組成特性、三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力分析了蛋白的耐熱機(jī)制。分析顯示，PeaT1及其突變體蛋白的氨基酸組成具有如下共同特征：含有較多的帶電氨基酸形成鹽橋；含有較多疏水氨基酸形成強(qiáng)大的疏水作用力；含有較