基于HBV的TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)改進(jìn)及干擾分析.pdf

1、目的：
　　1.在TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，以乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）為研究對(duì)象，排除由引物探針聚合延伸引起的假陽性問題，減輕氣溶膠的污染程度和引物二聚體（Primer Dimer，PD）的干擾程度；
　　2.使用新型探針及引物建立新型檢測(cè)體系，并對(duì)所建方法進(jìn)行應(yīng)用評(píng)價(jià)；
　　3.對(duì)探針法雙重PCR成份進(jìn)行分析，并指出其中影響靶模板檢測(cè)靈敏度的主要因素。
　　方法：

2、　　1設(shè)計(jì)普通TaqMan探針HBVP1、新型TaqMan-分子信標(biāo)探針HBVP2、HBVP3和引入反義堿基的新型探針 HBVP4，分別對(duì)四種探針進(jìn)行引物探針聚合試驗(yàn)，并比較不同反應(yīng)條件（儀器熱蓋和礦物油封閉情況）；對(duì)比四種探針的淬滅效率和應(yīng)用于質(zhì)粒檢測(cè)時(shí)的靈敏度；在雙重 PCR中，對(duì)共用一對(duì)引物的不同模板進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性干擾試驗(yàn)，對(duì)不共用引物模板進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性雙重PCR，觀察其出現(xiàn)干擾作用的濃度倍數(shù)關(guān)系；分別設(shè)計(jì)管家基因GAPDH、β-glo

3、bin和Alb的引物，檢測(cè)其天然濃度，選擇合適管家基因作為內(nèi)標(biāo)基因。
　　2.使用優(yōu)化后的體系，檢測(cè)梯度系列稀釋的HBV質(zhì)粒，作標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析其線性范圍和靈敏度；取107 IU/mL、105IU/mL、103IU/mL三個(gè)質(zhì)粒濃度進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算其變異系數(shù)；使用該體系檢測(cè)HBV和其它DNA病毒陽性樣本。收集中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科、消化內(nèi)科、查體及其他已有核酸檢測(cè)結(jié)果樣本共459例，使用新建體系進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.對(duì)

4、乙型肝炎病毒基因設(shè)計(jì)普通引物對(duì)和中部同序引物對(duì)，比較引物二聚體(Primer dimer, PD)含量；在控制內(nèi)標(biāo)基因的Ct值在30左右的情況下，調(diào)整內(nèi)標(biāo)引物濃度至10μmol/L、8μmol/L、5μmol/L、2μmol/L和1μmol/L，比較不同體系的檢測(cè)靈敏度；控制內(nèi)標(biāo)引物的用量不變，分別測(cè)定內(nèi)標(biāo) Ct值在15、20、25、30時(shí)靶模板檢測(cè)的靈敏度。
　　結(jié)果：
　　1.引物與探針聚合實(shí)驗(yàn)中，含有反義堿基的HBVP

5、4在重復(fù)試驗(yàn)中未出現(xiàn)假陽性；競(jìng)爭(zhēng)性雙重PCR和非競(jìng)爭(zhēng)性雙重PCR兩模板開始出現(xiàn)干擾作用的濃度差分別為20倍和100倍；對(duì)于內(nèi)標(biāo)基因，使用中部同序引物對(duì)以及普通引物對(duì)分別可以檢測(cè)到10-9和10-8稀釋度。3種HBV基因檢測(cè)體系，使用普通引物對(duì)可以檢測(cè)到Ct33左右，加入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)和使用中部同序引物對(duì)均可檢測(cè)到Ct35左右。
　　2.新建體系的線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.997，線性范圍為103~108IU/mL，靈敏度為100IU/mL；10

6、7、105、103IU/mL三個(gè)濃度質(zhì)粒組內(nèi)變異系數(shù)分別為1.02％、0.81%、0.95%，組間變異系數(shù)分別為2.45%、1.72%、1.14%；體系僅能擴(kuò)增 HBV病毒DNA。檢測(cè)459例樣本，其中有199例呈HBV陽性。
　　3.中部同序引物PD的Ct值在35以上，普通引物對(duì)PD的Ct值在30-33之間；10μmol/L、8μmol/L、5μmol/L、2μmol/L和1μmol/L濃度的內(nèi)標(biāo)引物需要內(nèi)標(biāo)模板的濃度分別為5×

7、104 IU/mL、5×104 IU/mL、5×104 IU/mL、5×105 IU/mL、5×107 IU/mL；不同內(nèi)標(biāo)引物用量檢測(cè)靈敏度均為5×102 IU/mL，僅使用中部同序引物的單重PCR檢測(cè)靈敏度為5×101 IU/mL；內(nèi)標(biāo)Ct值在15、20、25、30時(shí)靶模板檢測(cè)的靈敏度分別為5×104 IU/mL、5×103 IU/mL、5×102 IU/mL、5×102 IU/mL。
　　結(jié)論：
　　1.在 TaqMa

8、n-分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)調(diào)整的基礎(chǔ)上引入反義堿基，可以在排除由引物和探針聚合延伸引起的假陽性問題，且對(duì)探針的淬滅效率和檢測(cè)靈敏度無影響；雙重 PCR中，使用非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)對(duì)靶模板干擾作用較??；在探針法中，使用中部同序引物對(duì)和加入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)均可降低 PD的干擾程度，提升檢測(cè)的靈敏度。2.新建HBV檢測(cè)體系線性重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)，應(yīng)用于臨床樣本檢測(cè)時(shí)準(zhǔn)確性高，可以用于大批量樣本檢測(cè)。
　　3.在雙重PCR檢測(cè)體系中，對(duì)靶模板檢測(cè)靈敏