Taqman實時熒光定量PCR檢測LPA基因拷貝數(shù)變異及與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性研究.pdf

1、穩(wěn)定性心絞痛是冠心病中最常見的一種類型。“人類基因組測序計劃”的完成揭開了疾病基因組研究的新模式，現(xiàn)已證明包括穩(wěn)定性心絞痛在內(nèi)的冠心病、糖尿病、多發(fā)性硬化等復(fù)雜性疾病均為眾多微效、低危險度、低外顯率的易感基因和環(huán)境因素相互作用的綜合結(jié)果。鑒定疾病易感基因，將疾病發(fā)生發(fā)展中的特征與基因多態(tài)性（特異性分子表型） 組合在一起，闡明特異性分子表型之間的相互作用及與疾病的不同表型特征的對應(yīng)關(guān)系已成為“后基因組時代”的首要任務(wù)。故對于冠心病

2、（心絞痛）易感基因的分析有著深遠的意義。 既往研究表明：脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)] 是冠心病等動脈粥樣硬化性疾病的獨立危險因素，可促進粥樣硬化斑塊的進展和血栓的形成。人類LPA基因定位于6q26-27，存在多種結(jié)構(gòu)變異：其Kringle VI編碼區(qū)的重復(fù)序列(K4-VNTR)和位于5’調(diào)控區(qū)1373bp處起始密碼子的前5個核苷酸(TTTTA)n的重復(fù)序列(PNR)與血Lp(a)水平密切相關(guān)。全基因組

3、的比較基因組雜交技術(shù)證實了LPA基因染色體的DNA片斷存在重復(fù)和缺失（拷貝數(shù)變異）。但目前未有文獻對LPA基因拷貝數(shù)變異情況進行定量分析，亦未與疾病進行關(guān)聯(lián)性研究。 本研究目的在于：1.利用Taqman熒光探針技術(shù)，構(gòu)建LPA基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法。2.分析中國漢族人群脂蛋白（a）(LPA)基因拷貝數(shù)變異分布情況。3.評價中國漢族人群LPA基因與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性。 本文分為兩部分： 第一部分：利用Ta

4、qman熒光探針技術(shù)，構(gòu)建LPA基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法。 方法：參照GeneBank收錄的目的基因LPA和內(nèi)參基因ALB基因組全序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計并合成引物及Taqman探針，分別擴增長度為89bp和139bp的DNA片段,所擴增片段為非特異性管家片段，將產(chǎn)物純化并連接到pMD18-T載體進行克隆，挑取陽性克隆菌落提取質(zhì)粒，測序鑒定后等拷貝數(shù)混合構(gòu)建陽性質(zhì)粒標準品。優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)條件，建立標準曲線。將建立的L

5、PA/ALB熒光定量PCR檢測方法對人基因組進行檢測，分別測試不同濃度梯度下人基因組DNA和不同拷貝數(shù)梯度下質(zhì)粒擴增的穩(wěn)定性。據(jù)標準曲線，分別得出樣本LPA和ALB基因拷貝數(shù)的絕對值（即Quantity ct，Qct）與相對比值（即拷貝數(shù)變異值）。人基因組DNA10倍濃度梯度下稀釋以及陽性質(zhì)粒標準品10倍等拷貝數(shù)梯度下稀釋后，重復(fù)三次擴增，通過計算循環(huán)閾值（CT值）的平均值及標準差，檢測每個樣品反應(yīng)管之間的變異系數(shù)（CV％）。選取最適宜

6、的人基因組模板擴增濃度，隨機挑選３個樣品在一次擴增反應(yīng)中進行３次重復(fù)測定，再次鑒定不同樣品間變異系數(shù)。 結(jié)果：對反應(yīng)體系、循環(huán)條件、退火溫度進行優(yōu)化后獲得LPA和ALB基因?qū)崟r熒光定量PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。將LPA和ALB質(zhì)粒標準品10倍梯度稀釋后于定量PCR儀上擴增得到擴增曲線，據(jù)此建立相應(yīng)的標準曲線：LPA標準曲線斜率為-3.388,截距為29.657,相關(guān)系數(shù)為0.999,直線方程為Y=-3.388X＋29.657。

7、ALB標準曲線斜率為-3.256,截距為31.713,相關(guān)系數(shù)為0.999,直線方程為Y=-3.256X＋31.713。其中，Y為循環(huán)閾值，X為質(zhì)粒模板的拷貝數(shù)。表明可采用標準曲線法計算LPA和ALB基因的絕對含量和相對比值。 對人基因組DNA10倍濃度梯度擴增以及陽性質(zhì)粒標準品10倍等拷貝數(shù)梯度擴增重復(fù)性檢驗后，結(jié)果顯示：各組CT值變異均在合理范圍（＜5％），組間離散度小。2ng/μL為最佳樣品擴增起始模板濃度。對多個樣品單次

8、實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)的重復(fù)性檢驗示變異系數(shù)在合理范圍（＜5％），具有較高的可重復(fù)性。 結(jié)論：本研究所建立的實時熒光定量PCR檢測方法根據(jù)目的基因LPA和內(nèi)參基因ALB的非特異性管家序列，對引物、Taqman熒光探針濃度、Tm溫度等參數(shù)條件進行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)。通過制備陽性質(zhì)粒標準品成功構(gòu)建標準曲線。同時對人基因組DNA和陽性質(zhì)粒標準品進行不同濃度/等拷貝數(shù)梯度下的重復(fù)性檢驗，多樣本重復(fù)性檢驗示變異系數(shù)小、

9、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，故對于檢測LPA基因拷貝數(shù)變異具有較高可行性。 第二部分：研究中國漢族人群脂蛋白（a）(LPA)基因拷貝數(shù)變異與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性。 方法：入選瑞金醫(yī)院穩(wěn)定性心絞痛患者203例（63.7±8.3歲，男性53.2％)，對照組207名(64.2±8.2歲，男性46.8％),獲得知情同意后采集肘靜脈血10mL,抽提DNA。利用所建立的LPA/ALB實時熒光定量PCR檢測方法對臨床樣本進行檢測，比較兩組間L

10、PA基因拷貝數(shù)分布頻率，分析LPA基因拷貝數(shù)變異與穩(wěn)定性心絞痛的關(guān)系。 結(jié)果：兩組在性別和年齡上匹配，BMI指數(shù)、舒張壓(DBP)、TG、LDL-C、空腹血糖、高Lp(a)血癥(P=0.064)比例無顯著性差異，穩(wěn)定性心絞痛組吸煙者比例（P=0.008)、收縮壓（SBP）(P=0.023)、TC(P＜1×10-3)均高于對照組,HDL-C（P=0.036）低于對照組。 根據(jù)公式NLPA=（Qct LPA/ Qct ALB

11、)×2(即ALB的相對拷貝數(shù))，共檢測到NLPA=1、2、3三種LPA基因拷貝數(shù)變異情況。NLPA=1為單倍體，NLPA=2、3為多倍體，對其分布頻率進行研究后發(fā)現(xiàn)：LPA基因拷貝數(shù)變異在兩組的分布存在顯著性差異（χ2=13.614,P＜1×10-3）。穩(wěn)定性心絞痛組單倍體分布頻率顯著低于對照組（26.1％ vs43.5％），單倍體相對比值比OR=0.459(95％CI:0.303-0.697)。校正發(fā)病年齡、性別、BMI指數(shù)、收縮壓（

12、SBP）、舒張壓（DBP）、血糖、血脂、吸煙、高Lp(a)血癥等相關(guān)因素，進行多因素Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)：LPA基因單倍體相對比值比OR=0.27（95％CI:0.15-0.489，P＜1×10-3)。 根據(jù)血Lp(a)水平，將血Lp(a)≥0.3g/L定義為高Lp(a)血癥，比較LPA基因單倍體和多倍體攜帶者高Lp(a)血癥與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)：單倍體攜帶者中，穩(wěn)定性心絞痛組高Lp(a)血癥比例與對照組相似（

13、36.7％ vs40.7％，P＞0.05）。多倍體攜帶者中，穩(wěn)定性心絞痛組高Lp(a)血癥比例顯著高于對照組（39.4％ vs 21.7％，P=0.028）。校正了發(fā)病年齡、性別、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、BMI指數(shù)、血脂、血糖、吸煙等相關(guān)因素后，多因素Logistic回歸分析顯示：多倍體攜帶者，高Lp(a)血癥的相對比值比OR=2.246（95％CI:1.09-4.631）。 結(jié)論：LPA基因的拷貝數(shù)變異與穩(wěn)定性心絞