癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接細(xì)胞間通訊調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理的研究.pdf

1、目的： 建立大腸癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間縫隙連接通訊的模型，探討大腸癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附并建立縫隙連接細(xì)胞間通訊的條件，以及縫隙連接細(xì)胞通訊使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和機(jī)能變化的機(jī)制，從基因水平闡明癌細(xì)胞之所以能穿出血管內(nèi)皮進(jìn)入靶器官繼續(xù)生長形成轉(zhuǎn)移瘤的機(jī)理，為防治腫瘤轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。 方法： 1、細(xì)胞培養(yǎng) 胎兒臍靜脈灌注消化法獲得人血管內(nèi)皮細(xì)胞，自制牛腦提取物加入培養(yǎng)基中；與不同轉(zhuǎn)移能力的人大腸癌細(xì)胞系

2、HT29、Lovo細(xì)胞共培養(yǎng)。 2、縫隙連接細(xì)胞間通訊的檢測 使用熒光分子探針6-羥基熒光素乙酰乙酸脂，以激光漂白后熒光恢復(fù)技術(shù)，對單獨(dú)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞及與HT29細(xì)胞、Lovo細(xì)胞共培養(yǎng)之內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行ACAS-570共聚焦激光掃描顯微鏡檢測。 3、通訊連接蛋白Cx43基因表達(dá)的檢測 采用免疫組化SP法，檢測單獨(dú)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)組、HT29細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組、Lovo細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組的Cx43蛋白表達(dá)

3、情況。 4、內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白Actin的檢測 利用ACAS-570共聚焦激光掃描顯微鏡，系統(tǒng)觀察單獨(dú)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞及與HT29細(xì)胞、Lovo細(xì)胞共培養(yǎng)之內(nèi)皮細(xì)胞中Actin的定位和結(jié)構(gòu)變化。 5、基因轉(zhuǎn)化 設(shè)計(jì)E-選擇蛋白的全基因片段引物并進(jìn)行擴(kuò)增，將其與pMD18-T載體連接。然后將含E-選擇蛋白基因的pMD18-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再行質(zhì)粒擴(kuò)增和酶切分析。 結(jié)果： 1、以自制的牛腦提取物

4、代替生長因子，成功培養(yǎng)了人血管內(nèi)皮細(xì)胞。 2、相鄰接觸的內(nèi)皮細(xì)胞在激光漂白后出現(xiàn)熒光恢復(fù)現(xiàn)象。單獨(dú)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)組細(xì)胞經(jīng)漂白處理后，胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度開始緩慢上升，而其相鄰接觸細(xì)胞的熒光強(qiáng)度開始逐漸下降。漂白后2.5min時(shí)，被漂白細(xì)胞的熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰，隨后進(jìn)入一個(gè)相對穩(wěn)定階段。漂白后5.2min時(shí)，相鄰兩細(xì)胞的熒光強(qiáng)度達(dá)到一致。與其它細(xì)胞無接觸的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞在熒光漂白后無熒光恢復(fù)現(xiàn)象。而HT29細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組較單獨(dú)內(nèi)皮細(xì)胞

5、培養(yǎng)組熒光恢復(fù)明顯減緩；Lovo細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組熒光恢復(fù)更慢。 3、通訊連接蛋白Cx43免疫組化染色顯示，陽性細(xì)胞胞膜呈棕黃色。單獨(dú)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)組的細(xì)胞呈彌漫強(qiáng)陽性著色；低轉(zhuǎn)移能力的HT29細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組陽性細(xì)胞數(shù)量和著色強(qiáng)度明顯低于內(nèi)皮細(xì)胞；而高轉(zhuǎn)移能力的Lovo細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組的細(xì)胞幾乎無Cx43陽性表達(dá)。 4、內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白Actin的免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)的Actin分布

6、均勻，細(xì)胞間連接緊密，無間隙形成；而HT29細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組中內(nèi)皮細(xì)胞周邊的Actin基本消失，出現(xiàn)應(yīng)力纖維（變粗、變短、紊亂），排列呈明顯的極向分布，細(xì)胞間縫隙形成；Lovo細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)組此表現(xiàn)更加顯著。 5、用設(shè)計(jì)的E-選擇蛋白的引物成功擴(kuò)增出大小為3893bp的基因片段，成功構(gòu)建了pcDNA3.1<'+>/E-selectin重組體。 結(jié)論： 1、大腸癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間建立的縫隙連接細(xì)胞間

7、通訊減少，高轉(zhuǎn)移能力的Lovo細(xì)胞的縫隙連接通訊數(shù)目減少尤其明顯。 2、Cx43表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞與大腸癌細(xì)胞粘附后，Cx43的表達(dá)降低甚至缺失，使細(xì)胞間通訊異常，機(jī)體對細(xì)胞的監(jiān)視和調(diào)控能力減弱。 3、大腸癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附后，可影響Actin在內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中的分布狀態(tài)，致細(xì)胞間裂隙形成。 意義： 縫隙連接是進(jìn)行細(xì)胞間物質(zhì)和信息直接交流的細(xì)胞連接形式，也是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間存在的