縫隙連接介導的細胞間信號影響順鉑抑制腫瘤作用及其機理研究.pdf

1、本研究將為闡明腫瘤對順鉑產(chǎn)生耐藥性的機理提供新的依據(jù)和理論基礎，為癌痛患者化療時合理使用鎮(zhèn)痛藥提供理論依據(jù)。 第一章由Cx26/Cx32組成的縫隙連接對順鉑毒性的影響 目的： 本研究擬在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的HeLa細胞上，用多種方法改變GJ功能，通過觀察GJ功能改變對順鉑細胞毒性的影響，深入探討GJ與順鉑細胞毒性的關系。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的HeLa細胞，用"

2、標準細胞集落形成分析法"和SRB法測定順鉑對細胞生長的抑制作用。 結(jié)果： 1.不同細胞生長密度對順鉑細胞毒性的影響 細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在生長融合和生長未融合的細胞，5μM順鉑作用1小時后，都能夠顯著地降低細胞集落形成率。在生長融合細胞，順鉑對細胞集落生長的抑制率明顯高于生長未融合細胞。 2.改變Connexin表達對順鉑細胞毒性的影響 Western Blotting結(jié)果顯示，未加dox

3、ycycline的細胞無Cx表達。隨著doxycycline濃度的增加，Hela細胞內(nèi)Cx26/Cx32蛋白表達水平逐漸增加。細胞接種熒光示蹤實驗顯示，隨著doxycycline濃度的增加，細胞通過GJ的熒光傳遞功能逐漸增強。 3.抑制GJ功能對順鉑細胞毒性的影響 細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，25μM oleamide組和10μM18-α—GA組的細胞熒光傳遞功能顯著降低。 4.增強GJ功能對順鉑細

4、胞毒性的影響 細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，10μM RA組的細胞熒光傳遞功能增強。 結(jié)論： 1.GJ形成能夠顯著增強順鉑的細胞毒性；而Cx在未形成GJ前并不影響順鉑的細胞毒性。 2.降低GJ功能可降低順鉑的細胞毒性。 3.增加GJ功能可增強順鉑的細胞毒性。 第二章不同Cx組成的縫隙連接對順鉑細胞毒性的影響 目的： 本研究擬用已經(jīng)建立的，轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達單一 Cx

5、26或Cx32的Hela細胞，以及天然表達Cx43的TM4細胞，觀察由不同Cx組成的GJ對順鉑細胞毒性的影響；并探討GJ的功能狀態(tài)與順鉑細胞毒性的關系。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達單一 Cx26，Cx32的HeLa細胞及天然表達Cx43的睪丸支持細胞，用“標準細胞集落形成分析法”測定順鉑對細胞生長的抑制作用。用不同密度接種細胞的方法，獲得生長融合細胞與生長未融合細胞。在上述不同密度接種的細胞，觀察由單一 Cx26，Cx32

6、及Cx43組成的GJ對順鉑的細胞毒性影響。 結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)染Cx26，Cx32的Hela細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在生長融合和生長未融合的細胞，順鉑對細胞集落形成的抑制作用與細胞生長的融合程度有關。在生長融合細胞，順鉑對集落形成的抑制作用顯著高于生長未融合細胞。 2.細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，25μMoleamide組和10μM18-α—GA組的細胞熒光傳遞功能顯著降低細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在高

7、密度接種細胞，用25μM oleamide和10μMα—GA抑制GJ功能，5μM順鉑對細胞集落形成的抑制作用顯著降低；而在低密度接種細胞，oleamide，18-α—GA對順鉑的集落形成抑制作用無明顯影響。 3.細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，10μM RA組細胞熒光傳遞功能顯著增強。細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在高密度接種細胞，用10μM RA增強GJ功能后，5μM順鉑對細胞集落形成的抑制作用顯著增強。而在低密度接種細胞

8、，RA對順鉑抑制集落形成的作用無明顯影響。 4.細胞接種熒光示蹤實驗顯示，在表達Cx43的TM4細胞中，與對照組相比，50 nM TPA組的細胞熒光傳遞功能顯著降低。細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在高密度接種細胞，用50 nM TPA抑制GJ功能，10μM順鉑對細胞集落形成的抑制率明顯增強。 5.Western Blotting結(jié)果顯示：siRNA處理后，TM4細胞中Cx43蛋白表達明顯降低。細胞接種熒光示蹤實驗顯示：siR

9、NA可明顯抑制由Cx43組成的GJ功能。 結(jié)論： 1.Hela細胞中，由單一 Cx26、Cx32組成的GJ形成能夠增強順鉑的細胞毒性；TM4細胞中，由Cx43組成的GJ形成能夠降低順鉑的細胞毒性。 2.抑制由Cx26或Cx32組成的GJ功能可降低順鉑的細胞毒性；增強由Cx26或Cx32組成的GJ功能可增加順鉑的細胞毒性。 3.抑制由Cx43組成的GJ功能增強順鉑的細胞毒性。 第三章Cx26/Cx3

10、2組成的細胞縫隙連接對順鉑誘導細胞凋亡的影響 目的： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的Hela細胞，觀察GJ功能變化對順鉑誘尋細胞凋亡的影響，并探討其機理。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的HeLa細胞，采用“Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞術”及“Hoechst33258熒光染色法”檢測細胞凋亡。 在生長融合的細胞，加doxycycline誘導Cx表達，獲得有GJ形成的細

11、胞；觀察GJ形成對順鉑誘導細胞凋亡的影響。在GJ形成的細胞中，用藥物改變GJ功能，觀察GJ功能變化對順鉑誘導細胞凋亡的影響。 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx26/Cx32的HeLa細胞，采用“比色法”檢測細胞凋亡通路中Caspase3，8，9活性。 結(jié)果： 1.“Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞術”及“Hoechst33258熒光染色法”結(jié)果均表明，20μM順鉑作用Hela細胞24小時，細胞凋亡率明顯增加。有GJ形

12、成的細胞，順鉑引起的細胞凋亡率明顯高于無GJ形成的細胞。 2.“Annexin V/PI雙染結(jié)合流式細胞術”及“Hoechst33258熒光染色法”結(jié)果均表明，在GJ形成的Hela細胞，20μM順鉑作用Hela細胞24小時，細胞凋亡率明顯增加。與單用順鉑組相比，GJ抑制劑oleamide與順鉑合用組的細胞凋亡率顯著降低。GJ增強劑RA與順鉑合用組的細胞凋亡率顯著高于順鉑單用組。 3.“比色法”測定結(jié)果表明，20μM順鉑作

13、用Hela細胞24小時，細胞內(nèi)Caspase3，8，9活性明顯增加。在有GJ形成的Hela細胞，順鉑引起的胞內(nèi)Caspase3和Caspase9活性升高程度顯著高于無GJ形成的細胞。用oleamide抑制GJ功能，顯著降低順鉑升高細胞內(nèi)Caspase3和Caspase9活性的作用。GJ增強劑RA與順鉑合用，可增強順鉑升高細胞內(nèi)Caspase3和Caspase9活性的作用。 結(jié)論： 1.由Cx26/Cx32組成的GJ能夠增

14、強順鉑誘導細胞凋亡的作用。 2.降低GJ功能可減弱順鉑誘導細胞凋亡的作用；升高GJ功能可增強順鉑誘導細胞凋亡的作用。 3.GJ可以通過線粒體途徑增高細胞內(nèi)Caspase3活性，增強順鉑誘導細胞凋亡的作用。 第四章鎮(zhèn)痛藥對細胞縫隙連接的作用及其對順鉑細胞毒性的影響 目的： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx32的Hela細胞，觀察三種不同化學結(jié)構(gòu)的鎮(zhèn)痛藥對GJ功能和順鉑細胞毒性的影響；并探討鎮(zhèn)痛藥改變GJ功能的作用

15、與其對順鉑細胞毒性影響的關系。 方法： 在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx32的HeLa細胞中，用“標準細胞集落形成分析法”測定順鉑對細胞生長的抑制作用。用不同密度接種細胞的方法，獲得生長融合細胞與生長未融合細胞。在上述有GJ形成和無GJ形成的細胞，觀察三種鎮(zhèn)痛藥對順鉑細胞毒性的影響。 采用“細胞接種熒光示蹤法”檢測三種鎮(zhèn)痛藥對由Cx32組成的GJ功能的影響。 Western Blotting法檢測三種鎮(zhèn)痛藥對細胞內(nèi)

16、Cx32蛋白表達水平的影響。 結(jié)果： 1.三種鎮(zhèn)痛藥對順鉑細胞毒性的影響 細胞集落形成實驗結(jié)果顯示：在生長融合和生長未融合的細胞，5μM順鉑作用1小時后，都能夠顯著地降低細胞集落形成率。在生長融合的細胞，10μg/ml曲馬多和氟比洛芬酯與順鉑聯(lián)用，可顯著降低順鉑的細胞毒性。而在生長未融合的細胞，10μg/ml曲馬多和氟比洛芬酯對順鉑的細胞毒性無明顯影響。 2.三種鎮(zhèn)痛藥對轉(zhuǎn)染Cx32的Hela細胞GJ功能的

17、影響 細胞接種熒光示蹤實驗顯示，與對照組相比，曲馬多和氟比洛芬酯組的細胞熒光傳遞功能顯著降低，結(jié)果表明曲馬多和氟比洛芬能降低由Cx32組成的GJ功能。而同樣濃度的嗎啡對細胞熒光傳遞無影響。 3.鎮(zhèn)痛藥對細胞內(nèi)Cx32蛋白表達的影響 Western Blotting結(jié)果顯示，未用doxycycline誘導的Hela細胞不表達Cx32。與對照組相比，10μg/ml的曲馬多作用1小時，可增加Cx32表達水平。但作用時