熱休克蛋白90抑制劑對(duì)未分化甲狀腺癌增殖及攝碘動(dòng)力學(xué)的影響.pdf

1、背景與目的：
　　 未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）惡性程度很高，預(yù)后極差，早期即可發(fā)生周?chē)M織浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且進(jìn)展迅速，外照射治療雖可暫時(shí)緩解但極易復(fù)發(fā)，經(jīng)典的化療方案收效甚微。研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)作為分子伴侶的熱休克蛋白90（heat shock protein90，HSP90）對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，正逐漸成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-

2、Allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG）是一種特異性的HSP90抑制劑，在體內(nèi)可阻斷腫瘤賴以生存的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)。本研究旨在通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，探討17-AAG對(duì)人ATC細(xì)胞增殖及凋亡等的影響，并分析其可能的作用機(jī)制。
　　 鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium/iodide symporter，NIS）位于甲狀腺濾泡細(xì)胞膜上，其功能是促進(jìn)碘的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。將NIS全長(zhǎng)DNA轉(zhuǎn)染入ATC細(xì)胞后可

3、誘導(dǎo)NIS的表達(dá)增高，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)碘的攝取。但由于腫瘤細(xì)胞攝取的碘不能進(jìn)行有機(jī)化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)碘迅速外流。本研究的目的是了解17-AAG對(duì)已轉(zhuǎn)染NIS基因的ATC細(xì)胞攝碘動(dòng)力學(xué)的影響，為這一基因工程與核素治療相結(jié)合的方案將來(lái)逐漸過(guò)渡到臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.對(duì)人ATC細(xì)胞系FRO進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。在96孔板中加入不同濃度梯度（0.1～10μM）的17-AAG，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72h后

4、，MTT法檢測(cè)各濃度組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)抑制率。
　　 2.收集分別經(jīng)0.1μM、1μM和10μM的17-AAG作用后繼續(xù)培養(yǎng)48h的FRO細(xì)胞，PI進(jìn)行DNA染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各期細(xì)胞的比例；Anncxin-V-FITC及PI雙重染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞所占的比例，計(jì)算凋亡率。
　　 3.提取經(jīng)1μM的17-AAG作用48h后的FRO細(xì)胞的總蛋白，Western-blot檢測(cè)17-AAG作用前后FRO細(xì)胞內(nèi)H

5、SP90、癌蛋白pAkt、Raf-1等表達(dá)的變化。
　　 4.堿裂解法提取已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hNIS，并用限制性內(nèi)切酶法對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　 5.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入FRO細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h通過(guò)瞬時(shí)攝125Ⅰ能力的測(cè)定初步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。
　　 6.G418抗性篩選以獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系hNIS-FRO。
　　 7.往hNIS-FRO細(xì)胞的培養(yǎng)基中引入125Ⅰ，進(jìn)行125Ⅰ內(nèi)流及外流的

6、系列實(shí)驗(yàn)，繪制時(shí)間.放射性曲線；并與未轉(zhuǎn)染組進(jìn)行對(duì)比。
　　 8.分析經(jīng)1μM的17-AAG作用24h后hNIS-FRO細(xì)胞125Ⅰ內(nèi)流及外流的變化，并與未經(jīng)藥物治療的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)不同濃度的17-AAG作用24、48及72h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈量效及時(shí)效依賴性。0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μM的17-AAG作用72h后的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為35.9％、40.8％、5

7、4.2％、63.9％、68.3％、73.6％和78.1％。
　　 2.經(jīng)17-AAG作用48h后，隨著藥物濃度增大，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期和G2/M期細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)呈劑量依賴性：對(duì)照組以及經(jīng)0.1、1、10μM的17-AAG作用48h的各治療組間的細(xì)胞凋亡率存在明顯差異。
　　 3.與對(duì)照組相比，經(jīng)1μM的17-AAG作用48h后的FRO細(xì)胞HSP90表達(dá)上調(diào)，癌蛋白pAkt、Raf-1等表達(dá)明顯

8、下調(diào)。
　　 4.重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物在5502bp和1922bp處形成兩條清晰條帶，可以證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所提取質(zhì)粒確實(shí)為pcDNA3.1-hNIS。
　　 5.pcDNA3.1-hNIS轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞后24h，瞬時(shí)攝125Ⅰ能力約為對(duì)照組的2.53倍。
　　 6.G418抗性的篩選濃度最終確定為700μg/ml。未轉(zhuǎn)染組的FRO細(xì)胞完全沒(méi)有G418抗性。
　　 7.往hNIS-FRO細(xì)胞的培養(yǎng)基中引入125Ⅰ后

9、，攝125Ⅰ能力較對(duì)照組明顯提高，60min時(shí)的125Ⅰ攝取率約為對(duì)照組的11.54倍；但當(dāng)孵育環(huán)境中的125Ⅰ去除后，125Ⅰ則快速外流，30min后hNIS-FRO細(xì)胞內(nèi)的125Ⅰ滯留率僅為初始的9.32％。
　　 8.1μM的17-AAG作用于hNIS-FRO細(xì)胞后24h，我們往培養(yǎng)液中加入125Ⅰ，在20～60min的時(shí)間段內(nèi)，藥物作用組的hNIS-FRO細(xì)胞攝125Ⅰ能力較對(duì)照組有了不同程度的提高；當(dāng)撤掉環(huán)境中的125

10、Ⅰ后0～30min，藥物作用組的hNIS-FRO細(xì)胞內(nèi)的125Ⅰ滯留率均較對(duì)照組明顯增加，125Ⅰ的外流減少，30min后17-AAG作用組的細(xì)胞內(nèi)125Ⅰ滯留率為32.69％，是對(duì)照組的3.51倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.17-AAG可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用呈量效及時(shí)效依賴性。
　　 2.17-AAG作用后，G0/G1期的ATC細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡率增加，也呈量效依賴性。證實(shí)17-AAG不

11、僅可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 3.17-AAG作用后HSP90表達(dá)上調(diào)，癌蛋白pAkt、Raf-1等表達(dá)下調(diào)。證實(shí)17-AAG的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用可能與細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期以及阻斷腫瘤內(nèi)的信號(hào)通路等有關(guān)。
　　 4.將NIS轉(zhuǎn)染入ATC細(xì)胞后可獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，其攝碘能力大大提高，而且這種攝碘能力完全是由NIS基因表達(dá)后介導(dǎo)的：此方法尚不能克服腫瘤細(xì)胞內(nèi)攝取的碘迅速外流的缺陷。