全基因組測(cè)序檢測(cè)慢性粒單核細(xì)胞白血病相關(guān)的新的體細(xì)胞突變.pdf

1、目的：本研究通過(guò)對(duì)慢性粒單核細(xì)胞白血病患者進(jìn)行全基因組測(cè)序，旨在增加對(duì)腫瘤發(fā)生過(guò)程中分子遺傳學(xué)異常的認(rèn)識(shí)，尋找與疾病相關(guān)的新的體細(xì)胞突變。
　　研究對(duì)象和方法：對(duì)3例確診 CMML患者標(biāo)本進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析?；蚪M DNA來(lái)源于患者初診時(shí)的骨髓標(biāo)本以及口腔粘膜標(biāo)本。DNA提取后首先通過(guò)Covaris系統(tǒng)片段化成大約350 bp的片段。然后對(duì)這些片段進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾，雙端加上接頭序列，再用PCR擴(kuò)增構(gòu)建文庫(kù)。所得的DNA文庫(kù)

2、利用Illumina HiSeq X平臺(tái)進(jìn)行150堿基長(zhǎng)度的雙端測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)，并通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選候選體細(xì)胞突變。選擇的突變最后通過(guò)PCR和Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1．3例初診CMML患者的骨髓樣本和正常對(duì)照的口腔粘膜組織樣本進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析，總共獲得了806.43Gb的原始數(shù)據(jù)量，最小平均測(cè)序深度為30.76×，6份樣本的全基因組覆蓋率均達(dá)到98％以上。
　　2．分別在3

3、例CMML患者中發(fā)現(xiàn)了2184個(gè)、5039個(gè)和1945個(gè)體細(xì)胞單核苷酸突變，其中位于外顯子編碼序列區(qū)域的突變分別為10個(gè)、31個(gè)和8個(gè)。體細(xì)胞插入/缺失在3例患者中的分布分別為35個(gè)、71個(gè)和27個(gè)，但僅有1個(gè)移碼插入/缺失位于外顯子編碼序列區(qū)域。
　　3．根據(jù)基因注釋結(jié)果，確定了22個(gè)具有蛋白改變功能的體細(xì)胞突變，分別為1個(gè)外顯子移碼插入/缺失、18個(gè)錯(cuò)義單核苷酸突變、2個(gè)終止子增加突變和1個(gè)終止子丟失突變。
　　4．為了

4、篩選出新的 CMML相關(guān)突變，我們檢索了 dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)以及COSMIC腫瘤體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)，確定了5個(gè)候選突變，并進(jìn)行了PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證，最后成功驗(yàn)證了3個(gè)錯(cuò)義單核苷酸突變，分別定位于基因AKAP4、COL2A1和MAML1。
　　結(jié)論：
　　1．在分子遺傳學(xué)層面，CMML所涉及的突變基因復(fù)雜多樣，具有高度異質(zhì)性。
　　2.通過(guò)對(duì)3例CMML患者進(jìn)行全基因組測(cè)序以及Sanger測(cè)序驗(yàn)證確定了新的體細(xì)胞突