紫杉醇誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡和抑制膀胱腫瘤生長的實驗研究.pdf

1、膀胱癌的新診病例中70％為淺表性膀胱癌，淺表性膀胱癌的首選治療為經(jīng)尿道切除。膀胱癌經(jīng)尿道切除后仍有較高的復(fù)發(fā)率和進展率。膀胱灌注治療可以殺死殘留的腫瘤細胞、降低復(fù)發(fā)率、延長復(fù)發(fā)間隔，也可能防止腫瘤進展，是淺表性膀胱癌經(jīng)尿道切除術(shù)后的常規(guī)輔助治療。 目前紫杉醇已是國際上繼阿霉素和含鉑類抗癌藥物之后的熱點抗腫瘤薪藥。美國FDA已批準紫杉醇用于轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌等的治療。紫杉醇是一種作用于有絲分裂紡錘體的藥物，阻滯真核細胞于G<

2、,2>/M期。低濃度時通過改變微管動力學變化，限制細胞有絲分裂，引起細胞體積和DNA含量異常，造成細胞死亡；高濃度時造成穩(wěn)定的微管束形成，增加了微管聚合體團塊體積，導(dǎo)致G<,2>/M期阻滯和細胞凋亡。紫杉醇對膀胱腫瘤具有顯著的療效，為目前所知膀胱腫瘤單藥化療之最，已進入臨床Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗。在評價紫杉醇的抗腫瘤作用中，凋亡是重要的指標和機制之一。 MNU誘導(dǎo)的膀胱腫瘤與人膀胱腫瘤的發(fā)生和生物學行為類似，經(jīng)歷從原位癌、肌層浸潤

3、和死亡的全過程，而且發(fā)現(xiàn)多種治療藥物對其誘導(dǎo)的晚期腫瘤無效，對早期腫瘤則效果明顯，這也符合臨床膀胱腫瘤治療的普遍情況。因此，可以用該模型進行膀胱腫瘤化療的研究。 本實驗以人膀胱癌EJ細胞株為靶細胞，觀察不同濃度紫杉醇作用后EJ細胞的形態(tài)學改變，以及紫杉醇誘導(dǎo)EJ細胞凋亡及抑制增殖的作用，并探討其作用的時間、劑量一效應(yīng)關(guān)系，分析紫杉醇誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡的機制，為紫杉醇用于膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。因為紫杉醇可能通過藥理作用，誘

4、導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，本研究用紫杉醇對MNU誘導(dǎo)的大鼠膀胱腫瘤模型進行膀胱灌注，并以細胞增殖周期比例、微血管密度和凋亡指數(shù)為指標對紫杉醇的抑瘤作用機制進行探討。體外培養(yǎng)人膀胱癌EJ細胞，以1、10、100、1000nmol/L紫杉醇處理12～72h后，應(yīng)用MTT比色法測定不同濃度紫杉醇對EJ細胞增殖的影響，并繪制劑量一效應(yīng)曲線；通過電鏡觀察檢測細胞凋亡；采用PI單染法用流式細胞儀檢測膀胱癌EJ細胞的凋亡率，測定細胞周期。

5、 雌性Wistar大鼠100只，100～12周齡，體重240±20克，隨機分成A、B、C、D和E共5組，每組20只。A組，膀胱灌注枸櫞酸緩沖液O．2mL，每2周一次，共4次，于第一次灌注后第8周行生理鹽水O.5mL膀胱灌注每周1次共6次；B、C、D和E組大鼠膀胱灌注MNU溶液0.2mL，每2周一次，共4次，誘導(dǎo)膀胱癌。B、C、D和E組于第一次灌注后第8周分別行生理鹽水、魚軟骨多糖溶液、草分枝桿菌制劑和紫杉醇二甲亞砜溶液O.5mL

6、膀胱灌注，每周1次共6次。于最后1次灌注后24小時以膀胱絕對重量與體重的比值(膀胱相對重量)作為膀胱腫瘤的生長參數(shù)進入統(tǒng)計分析。并于第8、14周每組隨機抽取2只大鼠，病理學檢查。 B和E組膀胱標本病變明顯處取材，置人10％中性福爾馬林溶液中固定，制作石蠟包埋標本，應(yīng)用免疫組織化學SABC法以CD34標記血管內(nèi)皮測定微血管密度。其余腫瘤組織制成單細胞懸液以Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒，流式細胞儀檢測凋亡細胞比率；另吸取單細

7、胞懸液，流式細胞儀檢測細胞周期。 結(jié)果： 紫杉醇能抑制EJ細胞的生長，并在一定劑量和時間范圍內(nèi)呈現(xiàn)出時間、劑量依賴關(guān)系。電鏡下凋亡細胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮致密，并沿核膜分布形成新月形。流式細胞儀檢測觀察到細胞周期阻滯于G<,2>/M期，高濃度(100、1000nmol/L)明顯出現(xiàn)凋亡峰，細胞的凋亡率隨紫杉醇濃度的增大而增加。 大鼠膀胱灌注MNU溶液后第8周時，B、C、D和E組均發(fā)生病變。粘膜上皮增生可達10層，

8、可見非典型增生和出現(xiàn)移行細胞癌I級。14周時，可見明顯膀胱腫瘤，腫瘤細胞浸潤可達肌層，腫瘤細胞異型明顯，有的表現(xiàn)為癌細胞高度未分化，移行上皮結(jié)構(gòu)特征完全消失，呈彌漫分布或排列成實體性癌巢。第14周B組大鼠膀胱重量大于A組；C、D和E等3個用藥組膀胱重量均小于B組，其中E組膀胱重量與B組比較有統(tǒng)計學意義。E組G<,2>/M期的腫瘤細胞多于B組，而S期腫瘤細胞少于B組；E組腫瘤細胞的凋亡率高于B組，而微血管密度低于B組。 紫杉醇能抑

9、制膀胱癌EJ細胞的生長，在一定劑量范圍內(nèi)呈時間濃度依賴性；紫杉醇能夠誘導(dǎo)EJ細胞凋亡，細胞凋亡率隨紫杉醇濃度的增大而增加。 MNU誘導(dǎo)的膀胱腫瘤模型與人膀胱腫瘤的發(fā)生和生物學行為類似，其早期腫瘤適合評價藥物對膀胱癌的治療作用。草分枝桿菌制劑和(魚,工)魚軟骨多糖連續(xù)膀胱灌注未表現(xiàn)出對膀胱腫瘤明顯的抑制作用，而紫杉醇二甲亞砜溶液則顯示出強大的抑制膀胱腫瘤生長的作用。紫杉醇灌注使膀胱腫瘤G<,2>/M期細胞增多，誘導(dǎo)大鼠膀胱腫瘤