纈沙坦對心力衰竭幼鼠心肌鈣調(diào)節(jié)蛋白作用的研究.pdf

1、[研究背景]心力衰竭(heart failure,HF)，又稱心功能不全，是指在正常靜脈回流情況下，心臟的排血量不能滿足機體代謝需要的一種復(fù)雜的臨床綜合征。近半個世紀(jì)以來，對HF發(fā)病機理及治療研究取得很大進展。目前針對心哀患者給予了相對完善的治療方案，但心衰的發(fā)病率和死亡率仍然呈現(xiàn)上升趨勢。紐約心臟協(xié)會(New York Hteart Association，NYHA)心功能分級Ⅲ-Ⅳ的患者兩年死亡率高達50％。在兒科臨床，HF是最常見

2、的危重急癥之一，也是兒科臨床的重要死亡原因。因此進行HF發(fā)病機理及治療藥物的深入研究具有重要的理論價值和臨床指導(dǎo)意義。 心肌細胞舒縮功能的維持與胞內(nèi)鈣離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)是密不可分的。興奮-收縮偶聯(lián)(excitation-contraction coupling，E-C coupling)過程中，細胞膜的去極化使膜上的L型鈣通道(L-type Ca2+channel，LTCC)開放，少量的Ca2+內(nèi)流。內(nèi)流的Ca2+進一步激活與LTC

3、C緊挨著的肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum，SR)上的Ca2+釋放通道-2型蘭尼堿受體(type 2 ryanodine receptor，RyR2)，RyR2構(gòu)型改變，通道開放，大量Ca2+經(jīng)RyR2從SR釋放出來，當(dāng)心肌細胞內(nèi)游離[Ca2+]達10-5mol/l時肌鈣蛋白被激活，肌鈣蛋白I構(gòu)象改變使肌球蛋白和肌動蛋白相互接觸，引起細胞的收縮；舒張期開始于Ca2+從肌鈣蛋白上的解離，大部分(70％)被SR上受到受磷

4、蛋白(phospholamban，PLB)磷酸化水平調(diào)控的Ca2+_ATP酶(Ca2+-ATPase，SERCA2a)重吸收到SR內(nèi)，少部分(28％)通過胞膜上的Na+/Ca2+交換體泵出到細胞外，當(dāng)胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度降低達10-7mol/L時，肌球蛋白和肌動蛋白分離，引起心肌細胞舒張，形成一個完整的心臟收縮一舒張過程。有研究提示心肌細胞膜上G-蛋白偶聯(lián)受體(G α q-coupled receptors，G-R)和β-腎上腺素受體

5、(β-adrenergic receptor，β-AR)信號通路的過度激活可導(dǎo)致SR膜上SERCA2a、RyR2及其相關(guān)蛋白-FKBP12.6(FK506 binding protein，F(xiàn)KBP12.6)結(jié)構(gòu)和功能異常，使細胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運失衡，導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能異常。目前關(guān)于小兒HF時Ca2+轉(zhuǎn)運的改變以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(Angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB)類藥物對HF時RyR2和

6、SERCA2a的調(diào)節(jié)尚未見研究報道。 [目的]觀察HF時SR膜PLB磷酸化狀態(tài)，SERCA2a酶活性及Ca2+轉(zhuǎn)運變化，并探討ARB類(纈沙坦，Valsartan)對其干預(yù)作用。 [方法] 5周齡Wistar幼鼠，腹主動脈-下腔靜脈造瘺法建立心衰模型，術(shù)后8周隨機分為2組：心衰組和纈沙坦治療組，另設(shè)假手術(shù)對照組。纈沙坦灌胃給藥，每日觀察幼鼠的呼吸、皮毛顏色、活動量等發(fā)育情況，4周后超聲檢測幼鼠心功能：左室舒張末期內(nèi)徑(l

7、eft ventricular internal dimension diastole，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)、左室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左室收縮末期容積leftventricular end-systolic volume，LVESV)、左室射血

8、分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)后處死大鼠，心尖組織行HE染色，觀察形態(tài)學(xué)改變；左心室組織提取SR膜，Westem blotting法測定PLB磷酸化水平；定磷法測定SERCA2a酶活性；熒光分光光度儀檢測鈣離子(Ca2+)的重吸收和滲漏。 [結(jié)果] 與假手術(shù)組(n=15

9、)比較，HF組(n=15)幼鼠LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV均明顯升高(P＜0.01)，LVEF、LVFS均明顯降低(p＜0.01)，與HF組比較，纈沙坦治療組(n=20)LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV均明顯降低(P＜0.01)，LVFS、LVEF升高(P＜0.01)；與假手術(shù)組比較，HF 組體重(body weight，BW)降低(P＜0.01)，左心室相對質(zhì)量(left ventricular rel

10、ative weight，LVRW)、右心室相對質(zhì)量(right ventricular relative weight，RVRW)均明顯升高(P＜0.01)，纈沙坦治療組BW(P＜0.01)升高，LVRW、RVRW降低(P＜0.01)；光鏡下HF組心肌細胞排列紊亂，水腫、變性、局灶壞死，纈沙坦治療組的病理改變明顯減輕而假手術(shù)組幼鼠未見HF組的病理改變；三組大鼠SR膜SERCA2a活性比較結(jié)果顯示，HF組的SERCA2a活性較假手術(shù)組明

11、顯降低(P＜0.01)，而經(jīng)纈沙坦治療后，酶活性接近假手術(shù)組(P＞0.05)；與假手術(shù)組比較，HF組16位絲氨酸磷酸化-受磷蛋白(Serine Phosphate16-PLB，Ser-16-PLB)蛋白量顯著降低(P＜0.01)，與HF組比較，纈沙坦治療組Ser-16-PLB蛋白量明顯升高(P＜0.01)，接近假手術(shù)組水平；三組總PLB蛋白量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；若分別向含有三組SR的緩沖液加入三磷酸腺苷(adenosine

12、 triphosphate，ATP)(0.5mmol/L)后，HF組的Ca2+的重吸收量同假手術(shù)組和纈沙坦治療組比較，明顯降低(P＜0.01)；當(dāng)分別向含有三組SR的緩沖液中加入thapsigargin(1μmol/L)后，HF組同另外兩組比較出現(xiàn)明顯的Ca2+滲漏(P＜0.01)；而當(dāng)thapsigargin(1μmol/L)和FKBPl2.6抑制劑-FK506(30μmol/L)一起加入三組SR的緩沖液中，假手術(shù)組、治療組出現(xiàn)明顯的

13、Ca2+滲漏(P＜0.01)，而HF組較單獨加入thapsigargin(1μmol/L)時Ca2+滲漏僅輕微增多(P＞0.05)。 [結(jié)論] HF時心功能顯著降低，心肌組織肥厚，心肌細胞SERCA2a活性下降，心肌PLB磷酸化水平顯著降低，細胞Ca2+吸收量降低、滲漏明顯。纈沙坦一方面通過抑制去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)的釋放，阻止蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)對RyR2的過度磷酸