神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)示蹤研究.pdf

1、目的：利用超順磁氧化鐵粒子(SPIO)標(biāo)記大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，將其移植到創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)大鼠腦內(nèi)后，用MRI觀察到其在宿主腦內(nèi)的遷徙和分布：在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用錳增強(qiáng)磁共振(ME-MRI)技術(shù)檢測(cè)移植NSCs在腦損傷區(qū)所發(fā)揮的功能作用，以實(shí)現(xiàn)活體水平示蹤移植NSCs在動(dòng)物腦內(nèi)的遷徙以及功能重建的研究。同時(shí)，利用磁共振波譜(H-MRS)技術(shù)對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，從而在活體水平實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)性示蹤內(nèi)源性NSCs。
　

2、　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，對(duì)其Nestin表達(dá)進(jìn)行鑒定，并將其分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；用SPIO磁化標(biāo)記NSCs，通過普魯士藍(lán)染色明確轉(zhuǎn)染成功率，并測(cè)定SPIO標(biāo)記NSCs的活性。
　　2.根據(jù)Feeney氏法建立TBI大鼠模型，約1周后行SPIO標(biāo)記的NSCs立體定向腦內(nèi)移植，術(shù)后第1，7，14，21，30天以及3月分別行T2加權(quán)梯度回波(GRE)序列MRI掃描，以示蹤移

3、植NSCs在宿主腦內(nèi)的遷徙和分布等。
　　3.正常大鼠行ME-MRI掃描，經(jīng)靜脈輸注MnCl2.4H2O，用甘露醇開放一側(cè)大腦半球血腦屏障(BBB)，電刺激其對(duì)側(cè)前肢后，即行T1加權(quán)三維快速擾相位梯度回波(3D-FSPGR)序列掃描；而另一組正常大鼠在ME-MRI中行鈣通道阻滯劑實(shí)驗(yàn)，即在電刺激階段經(jīng)靜脈注射地爾硫卓。
　　4.接受SPIO標(biāo)記NSCs移植的TBI大鼠在移植后2-4周左右，MRI可示蹤到移植NSCs遷徙到腦損

4、傷區(qū)，大鼠腦切片普魯士藍(lán)染色證實(shí)SPIO標(biāo)記NSCs的存在，此時(shí)行ME-MRI掃描，實(shí)驗(yàn)步驟同正常大鼠。末接受NSCs治療的TBI大鼠亦行SPIO-MRI和ME-MRI掃描作為對(duì)照組，并比較兩組大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)表現(xiàn)的差別。
　　5.H-NMR測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間波峰差別，確定神經(jīng)干細(xì)胞的特定波峰及其與神經(jīng)發(fā)生區(qū)相關(guān)性，然后利用MRS檢測(cè)成年大鼠以及成人腦內(nèi)皮層和海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的含量。
　　結(jié)果：

5、　　1.細(xì)胞熒光免疫染色示大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞呈Nestin陽(yáng)性并能定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，SPIO轉(zhuǎn)染后行普魯士藍(lán)染色可見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的陽(yáng)性藍(lán)色顆粒，MTT法證實(shí)標(biāo)記細(xì)胞的存活率無降低。
　　2.根據(jù)Feeney氏法建立的TBI大鼠模型術(shù)后表現(xiàn)為對(duì)側(cè)肢體的活動(dòng)障礙，1周后行NSCs移植治療，術(shù)后用MRI觀察其在腦內(nèi)能向損傷病灶遷徙，表現(xiàn)為NSCs注射部位、腦損傷區(qū)周圍以及兩者之間的路線的低信號(hào)，并且腦損傷區(qū)及其

6、周圍腦切片普魯士藍(lán)染色可發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性藍(lán)色顆粒細(xì)胞，證實(shí)SPIO標(biāo)記的NSCs能遷徙到損傷區(qū)并向病灶內(nèi)彌散。
　　3.正常大鼠ME-MRI掃描顯示相應(yīng)的體感運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)和觸須皮層區(qū)存在高信號(hào)，表明局部有神經(jīng)元電活動(dòng)引起的錳離子聚集。而在電刺激過程中引入鈣通道阻滯劑地爾硫卓后，相應(yīng)體感運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)的高信號(hào)消失，而側(cè)腦室等區(qū)域仍表現(xiàn)為高信號(hào)，說明錳離子是伴隨著鈣通道的開放而進(jìn)入興奮性神經(jīng)細(xì)胞的，錳增強(qiáng)依賴性信號(hào)增加能夠被鈣通道阻斷劑拮抗。

7、>　　4.TBI大鼠接受經(jīng)SPIO標(biāo)記的NSCs移植治療后2-4周左右，用MRI可觀察到移植NSCs能從注射點(diǎn)遷徙到損傷病灶區(qū)，普魯士藍(lán)切片染色證實(shí)為SPIO標(biāo)記的NSCs。此時(shí)行ME-MRI掃描可發(fā)現(xiàn)大鼠肢體功能損傷區(qū)局部有高信號(hào)，而未行NSCs移植的TBI大鼠在ME-MRI上并未發(fā)現(xiàn)這些高信號(hào)區(qū)，在應(yīng)用鈣通道阻滯劑地爾硫卓后，這些高信號(hào)又消失。這些數(shù)據(jù)表明移植的NSCs不僅能遷徙到腦損傷區(qū)，而且能在病灶部位分化、形成有功能的突觸聯(lián)系

8、并參與局部大腦功能活動(dòng)。與此相一致的是，經(jīng)NSCs治療的TBI大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)評(píng)分較未行NSCs移植的TBI大鼠有明顯的改善。
　　5.H-NMR體外測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞存在1.28ppm特定波峰，并與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)；然后利用MRS分析成年大鼠以及成人腦內(nèi)皮層和海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的含量，經(jīng)SVD轉(zhuǎn)換檢測(cè)到成年大鼠和成人腦內(nèi)海馬區(qū)存在少許神經(jīng)干細(xì)胞，而皮層區(qū)檢測(cè)不到神經(jīng)干細(xì)胞，這與成體腦內(nèi)海馬區(qū)存在神經(jīng)發(fā)生相一致。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)