骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨示蹤研究.pdf

1、研究背景及目的：股骨頭壞死(osteonecrosis of femur head，ONFH)是臨床上較為常見的難治性疾病之一，多數(shù)進(jìn)展至股骨頭塌陷從而繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，多數(shù)需行人工關(guān)節(jié)置換。目前ONFH的早期治療的重點(diǎn)在于保存股骨頭，防止塌陷。股骨頭的保存治療方法很多，但都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。近年來(lái)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)移植作為一種新的治療方法，也用于治療ONFH。MSCs移植后在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸與作用

2、機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。為監(jiān)測(cè)活體內(nèi)移植細(xì)胞的分布、增殖、遷移等，傳統(tǒng)方法都需要在離體狀態(tài)下進(jìn)行組織學(xué)檢查，難以準(zhǔn)確地觀察植入細(xì)胞的生長(zhǎng)分化情況，無(wú)法對(duì)干細(xì)胞移植的療效做出客觀評(píng)價(jià)，從而極大的阻礙了干細(xì)胞移植在臨床應(yīng)用上的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和分子影像學(xué)概念的產(chǎn)生，人類開始能夠在細(xì)胞分子水平評(píng)價(jià)活體組織細(xì)胞的生物學(xué)過程。如利用MRI來(lái)監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞，其最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠無(wú)創(chuàng)地進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)。為能在MRI上區(qū)分移植細(xì)胞和靶組織細(xì)胞，需要

3、對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行移植前標(biāo)記。目前廣泛使用超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)標(biāo)記移植細(xì)胞。SPIO是一種納米級(jí)粒子，由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，SPIO即使在較弱的磁場(chǎng)中也可以產(chǎn)生較大的磁性，而外磁場(chǎng)撤消后磁性也迅速消失，即具有所謂的超順磁性，可以使MRI的靶區(qū)信號(hào)均明顯降低，產(chǎn)生負(fù)性對(duì)比劑的效應(yīng)，從而經(jīng)SPIO標(biāo)記的移植細(xì)胞團(tuán)也就可因含SPIO顆粒而顯示為低信號(hào)，這樣就間接反映了移植細(xì)胞的分布和

4、聚集情況。目前應(yīng)用SPIO進(jìn)行細(xì)胞的體內(nèi)示蹤主要應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)研究，在骨骼系統(tǒng)中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用SPIO進(jìn)行標(biāo)記細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)及模擬股骨頭壞死區(qū)移植細(xì)胞的體內(nèi)示蹤，旨在明確SPIO體外標(biāo)記狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的適當(dāng)條件，以及經(jīng)MRI體外成像的特征和可成像的最低標(biāo)記細(xì)胞量等；利用MRI進(jìn)行移植細(xì)胞的示蹤，結(jié)合組織學(xué)觀察移植細(xì)胞在股骨頭內(nèi)的存活及轉(zhuǎn)歸；探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨及促進(jìn)股骨頭壞死修復(fù)的能力。從而為

5、細(xì)胞移植的轉(zhuǎn)歸與作用機(jī)制研究打下工作基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療骨壞死找到一定的理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法：試驗(yàn)分兩部分。 ①超順磁性納米氧化鐵顆粒(SPIO)體外標(biāo)記MSCs：抽取狗的雙側(cè)髂骨骨髓，行梯度離心及貼壁細(xì)胞分離法分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。按不同SPIO濃度設(shè)定實(shí)驗(yàn)組，觀察不同實(shí)驗(yàn)組之間標(biāo)記率的差異性、對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響、MRI成像的特征和條件等，找到合適的標(biāo)記條件。觀察標(biāo)記后細(xì)胞的遠(yuǎn)

6、期增殖情況以及SPIO在細(xì)胞內(nèi)的存留穩(wěn)定性。 ②細(xì)胞的股骨頭壞死區(qū)內(nèi)移植及示蹤：制備股骨頭壞死模型。同時(shí)抽取狗雙側(cè)髂骨骨髓，行梯度離心及貼壁細(xì)胞分離法分離MSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。2周后，骨壞死區(qū)病灶刮除，將體外標(biāo)記了SPIO的MSCs與脫抗原小牛松質(zhì)骨復(fù)合，植入骨壞死區(qū)，另一側(cè)單純植入脫抗原小牛松質(zhì)骨作為對(duì)照，術(shù)后定期行活體MRI檢測(cè)，觀察不同時(shí)間段SPIO的體內(nèi)成像特點(diǎn)，并取材行組織學(xué)對(duì)照。利用顯微鏡、組織化學(xué)法及透射電鏡

7、等觀察SPIO的體外標(biāo)記情況。行普魯士藍(lán)染色觀察含鐵顆粒的細(xì)胞在體內(nèi)的分布、轉(zhuǎn)歸等情況。行HE染色及圖像分析，觀察MSCs在體內(nèi)的成骨效果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： ①SPIO可以很好的標(biāo)記MSCs，并長(zhǎng)期存留，適當(dāng)濃度下對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響，一定數(shù)量時(shí)體外可被MRI所檢測(cè)。 ②SPIO標(biāo)記細(xì)胞體內(nèi)移植側(cè)MRI檢測(cè)可見明顯低密度灶，3個(gè)月仍然可被檢測(cè)到。 ③股骨頭缺損內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量SPIO陽(yáng)性細(xì)胞，新骨形成越活躍的地方，SP