Rho相關(guān)激酶ROCK在缺氧致心肌細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 通過建立體外心肌細(xì)胞缺氧模型,觀察ROCK在不同缺氧時(shí)間點(diǎn)的表達(dá),探討其在心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.取健康乳鼠(出生1-3d),利用0.08％胰酶和1.00％Ⅱ型膠原酶依次消化心肌組織,混懸液經(jīng)差速貼壁2h后,加入0.1mM5-Brdu抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng),以1*106/ml的細(xì)胞密度接種于3.5mm的培養(yǎng)皿中,待心肌細(xì)胞生長(zhǎng)接近會(huì)和狀態(tài)及呈現(xiàn)同步搏動(dòng)時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。
　

2、　 2.利用缺氧液和缺氧盒,建立心肌細(xì)胞缺氧模型,分別缺氧培養(yǎng)1h、3h、6h、9h,以常規(guī)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為對(duì)照,檢測(cè):ROCK-1、ROCK-2的表達(dá)。
　　 3.取ROCK-1、ROCK-2表達(dá)的高峰時(shí)間點(diǎn),Erk5阻斷劑PD98059(終濃度20umol/L)進(jìn)行缺氧處理后,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　 4.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡,MTS檢測(cè)細(xì)胞存活率,Western blotting檢測(cè)ROCK-1、RO

3、CK-2、Erk5、p-Erk5、Caspase-3、PI3K、p-P13K的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.缺氧1h、3h、6h、9h后,心肌細(xì)胞凋亡率分別為8.76±1.51％,15.36±2.34％,26.50±3.43％,41.96±4.22％,與對(duì)照組(2.6±0.34％)比較均有顯著性差異,(均P<0.01)；存活率分別為93.20±4.12％,86.14±3.10％,75.53±7.25％,60.21±

4、6.75％,與對(duì)照組(97.60±1.12％),比較均有顯著性差異,(均P<0.05)
　　 2.ROCK-1、ROCK-2缺氧1h即開始升高,3-6小時(shí)表達(dá)達(dá)高峰,9小時(shí)開始回落,且均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 3.Caspase-3在缺氧1小時(shí)開始逐漸升高,在隨后觀察的時(shí)相點(diǎn)內(nèi)持續(xù)處于高表達(dá)狀態(tài),與對(duì)照組比較均有顯著性差異(均P<0.01)。
　　 4.PI3K各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)無明顯變化,而p-PI3

5、K在缺氧1h后開始升高,3小時(shí)達(dá)高峰,6小時(shí)開始回落,9h表達(dá)基本消失,各時(shí)間點(diǎn)比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.Erk5缺氧1h即開始升高,3-6小時(shí)表達(dá)達(dá)高峰,9小時(shí)開始回落,且均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 6.Erk5阻斷劑處理后,心肌細(xì)胞凋亡率較單純?nèi)毖?h組明顯升高(P<0.01),存活率較單純?nèi)毖?h組明顯下降(P<0.01)；ROCK-1、ROCK-2較單純?nèi)毖?h組升高(P<0