鏈霉親和素-beclin1重組載體的構(gòu)建以及融合蛋白的原核表達(dá)和純化.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer,PCa)是一種老年男性泌尿系統(tǒng)的疾病,隨著生活水平和診療手段的不斷提高以及我國人口進(jìn)入老齡化,前列腺癌發(fā)病率逐年增高。但是目前的醫(yī)療水平,使前列腺癌確診時(shí)基本已是中晚期,而且傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)治療、激素治療等療效欠佳,放化療等治療方法由于缺乏靶細(xì)胞的特異性,對正常的身體組織也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞,在臨床應(yīng)用上受到一定的限制,克服化療藥物的副作用,提高殺滅癌細(xì)胞的特異性,是目前比較重要的研究課題之一

2、。
　　激素非依賴性前列腺癌自噬作用缺失、抗凋亡能力增強(qiáng)可能是其腫瘤細(xì)胞增殖的原因。自噬相關(guān)基因 beclin1是目前新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,源于核孤兒受體的小肽NuBCP-9可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)的適配子能特異地與前列腺癌細(xì)胞結(jié)合。本課題擬利用鏈霉親和素-生物素技術(shù)將beclin1與小肽NuBCP-9以及PSMA適配子偶聯(lián)在一起,特異地增強(qiáng)

3、前列腺癌細(xì)胞的自噬和凋亡,試圖為前列腺癌的治療尋找一條有效的新途徑。
　　1、構(gòu)建SA-beclin1原核表達(dá)載體
　　從 GenBank中檢索出核心鏈霉親和素 Core SA基因的DNA序列后,利用in-Fusion引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)的SA的特異性引物。以Core SA作為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出SA,長度為381bp。自噬相關(guān)基因beclin1已在前期工作中構(gòu)建入原核表達(dá)載體 pQE80L,用 in

4、-Fusion方法連接 PCR產(chǎn)物 SA和pQE80L-beclin1,酶切鑒定并送公司測序。SA-beclin1測序結(jié)果與預(yù)期完全一致,重組載體構(gòu)建成功,命名為pQE80L-SA-beclin1。
　　2、融合蛋白SA-beclin1的原核表達(dá)與純化
　　將重組載體 pQE80-SA-beclin1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 Rosetta-gami原核表達(dá)菌,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白 SA-beclin1,通過優(yōu)化表達(dá)條件,選擇3

5、7℃,IPTG濃度0.5mmol/L,誘導(dǎo)5h。用鎳親和凝膠層析柱純化融合蛋白,Western blot鑒定融合蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)后SA-beclin1融合蛋白(含His標(biāo)簽)在大腸桿菌中高效表達(dá)。SDS-PAGE分析表達(dá)的融合蛋白以包涵體為主,經(jīng)鎳親和凝膠層析柱純化得到融合蛋白,Western blot鑒定其相對分子量約為72000,與預(yù)期相符。包涵體經(jīng)變性復(fù)性后,亦可得到與目的條帶大小相符的蛋白。
　　設(shè)計(jì)并合