沙眼衣原體E型omp1基因原核表達載體的構(gòu)建及表達和純化.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，C.t)所致的泌尿生殖道感染近幾年迅速增多，無癥狀和慢性C.t感染所致的前列腺炎、不孕不育、異位妊娠、慢性盆腔炎等嚴重危害著患者的身心健康。目前，C.t泌尿生殖道感染的遷延難治、易于復發(fā)和耗資巨大已成為共識，對C.t感染的研究已成為當今國內(nèi)外研究的熱點之一，C.t的預防和控制方法亟待改進。沙眼衣原體疫苗的研究便是預防措施中的重點之一。已有的研究表明沙眼衣原體主要外膜蛋白(major

2、 outer membraneprotein，MOMP)表位決定了保護性抗體的產(chǎn)生，并且特異性的作為抗體的靶抗原。其相對分子質(zhì)量為40×103，是衣原體外膜復合物的主要成分，占外膜總蛋白的60％以上，因此人們研究最多的蛋白疫苗是MOMP。 目的：構(gòu)建沙眼衣原體E型主要外膜蛋白基因(ompl)的原核表達載體，并在大腸桿菌(BL-21)中融合表達及鑒定，并獲得純化和定量后的MOMP。 方法：提取C.t E型ompl染色體DN

3、A作為模板，設計引物擴增出完整的ompl基因，與載體pGEX6p-1經(jīng)雙酶切后連接重組，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21；重組子經(jīng)抗生素平板篩選后，挑取生長的單菌落培養(yǎng)至對數(shù)生長期并提取重組質(zhì)粒，并用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI，NotI進行酶切分析、PCR擴增及部分序列測定等方法對重組質(zhì)粒進行鑒定。然后誘導表達，IPTG誘導融合蛋白表達，細菌裂解物離心的上清和沉淀分別行SDS-PAGE電泳。以抗谷胱甘肽抗體(anti-GST-tag antib

4、ody)作為一抗行Western-blotting技術(shù)初步鑒定和PCR擴增鑒定。然后采用GST樹脂親和層析的方法純化目的蛋白，純化后用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)進行蛋白定量，然后進行數(shù)據(jù)分析，評價MOMP蛋白的定量。 結(jié)果：PCR擴增產(chǎn)物在1200bp位置出現(xiàn)明顯條帶，并經(jīng)測序鑒定與Genebank上提供的E型C.t ompl基因全序列同源性達99.92％，氨基酸序列同源性達100％，證明C.t E型ompl基因擴增成功。omp

5、l-pGEX6p-1重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，分別在5000bp及1200bp位置出現(xiàn)條帶，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并且PCR擴增后在6000bp左右出現(xiàn)目的條帶，測序結(jié)果與GenBank登陸的Ct E血清型的Bour株ompl基因序列進行對比，結(jié)果完全一致。誘導后得到66KD蛋白，并可被GST特異性抗體檢測，蛋白印跡證實表達產(chǎn)物為特異性蛋白，用GST樹脂親和層析后也在相對分子量約66KD處有一條唯一的蛋白條帶，經(jīng)蛋白定量后獲得高濃度的M