膿毒癥調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能變化規(guī)律及發(fā)生機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的:
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells，Treg)是一類具有調(diào)節(jié)功能的成熟的T細(xì)胞亞群，對(duì)免疫耐受和免疫平衡的維持發(fā)揮著重要作用，在膿毒癥感染免疫中的作用也受到了越來越多的關(guān)注。Treg表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性兩大特性，主要通過細(xì)胞接觸機(jī)制和細(xì)胞因子分泌方式發(fā)揮作用。目前嚴(yán)重膿毒癥(seversepsis)患者臨床死亡率高達(dá)50％，膿毒癥發(fā)病機(jī)制中超過半數(shù)為革蘭陰性菌所致。在對(duì)革蘭陰性菌及其產(chǎn)物的識(shí)別中，T

2、oll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的橋梁。鑒于TLR4在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要性，而且其本身也為Treg細(xì)胞表面的膜分子，那么在膿毒癥發(fā)病過程中，TLR4是否通過作用于Treg影響了免疫功能紊亂的發(fā)生發(fā)展呢?本實(shí)驗(yàn)通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecelliagtionpuncture，CLP)建立膿毒癥模型，采用免疫磁珠分

3、離法(magneticcellsorting，MACS)分離小鼠脾臟的Treg，通過檢測(cè)膿毒癥中Treg細(xì)胞的功能變化和凋亡情況，以及TLR4表達(dá)的變化規(guī)律，分析膿毒癥Treg功能變化規(guī)律，并初步探討TLR4與Treg功能變化間的可能聯(lián)系。
　　方法:
　　(1)模型制備：SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨即分為模型(CLP)組及假手術(shù)(Sham)組，各20只，模型組行CLP建立膿毒癥小鼠模型，檢測(cè)術(shù)后24h、48h、72h存活率

4、情況，并于術(shù)后24h檢測(cè)正常(Normal)組、Sham組和CLP組外周血中細(xì)胞因子水平變化情況。
　　(2)采用免疫磁珠法分離獲取小鼠脾臟CD4+CD25-T細(xì)胞及CD4+CD25+Treg細(xì)胞，并鑒定細(xì)胞純度。
　　(3)分離小鼠CD4+CD25+Treg及CD4+CD25-T細(xì)胞，設(shè)單純效應(yīng)T細(xì)胞(effectorTcellTeff)對(duì)照組，另依CD4+CD25+Treg：Teff胞比例1:1，分別設(shè)置Teff細(xì)胞與S

5、ham組、CLP24h組和CLP48h組的Treg共培養(yǎng)，加入抗CD-3、抗CD-28共刺激72h，通過噻唑藍(lán)(thiazolylblue，MTT)比色分析法分析Treg對(duì)Teff增殖的抑制狀況。
　　(4)Treg與CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)68h后，分別留取細(xì)胞上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunoabsorbentassay，ELISA)法測(cè)定細(xì)胞因子的分泌情況。
　　(5)免疫磁珠法分離C

6、D4+CD25+Treg，用Annexin-V-FITC及Propidiumiodide(PI)標(biāo)記Treg，流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)Treg的凋亡情況。
　　(6)提取三組Treg的mRNA，SYBRGREEN法檢測(cè)TLR4及Treg的特異性標(biāo)志物叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor，F(xiàn)oxp3)mRNA表達(dá)情況。
　　(7)分離S

7、ham組、CLP24h組和CLP48h組小鼠Treg，分別Anti-MouseCD152、Anti-mouseFoxp3FITC和Anti-mouseTLR4(CD284)抗體標(biāo)記T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)、Foxp3以及TLR4，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)術(shù)后CLP組小鼠出現(xiàn)一系列符合膿毒癥癥狀的表現(xiàn)，死亡均

8、發(fā)生在術(shù)后12小時(shí)之后，72h死亡率50％，初步建立了穩(wěn)定的膿毒癥小鼠模型；造模后24h呈現(xiàn)出免疫功能的紊亂。
　　(2)經(jīng)過多次細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)證實(shí)，正常小鼠脾細(xì)胞經(jīng)過MACS兩次分選后，Treg細(xì)胞純度可達(dá)到92.13％～98.62％，CD4+CD25-T細(xì)胞純度可達(dá)88.70％～95.33％，所獲得的Treg細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活性大于96％。
　　(3)CD4+CD25-T細(xì)胞活化后表現(xiàn)出增殖反應(yīng)，與Treg共培養(yǎng)后CD4+

9、CD25-T細(xì)胞增殖反應(yīng)受到抑制，Sham組、CLP24h組和CLP48h組CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖抑制率分別為37.55％、53.91％、62.40％。
　　(4)與Normal組比較，Sham組、CLP24h組和CLP48h組共培養(yǎng)上清中促炎因子IL-2、IFN-γ明顯下降，抗炎因子IL-4、IL-10含量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以CLP24h組和CLP48h組變化更為明顯(P<0.01)，表

10、明膿毒癥Treg促使Teff發(fā)生由Th1向Th2的漂移。
　　(5)與Sham組相比，CLP后Treg的凋亡明顯減少，其中CLP48h組與Sham組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　(6)與Sham組相比，CLP24h和48h組Foxp3mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，以CLP48h組上升為著(P<0.01)。與Sham組比較，CLP24h和48h組Foxp3的蛋白表達(dá)亦明顯升高(P<0.05

11、或P<0.01)，且CLP48h組上調(diào)為著(P<0.01)；同時(shí)，CLP24h和48h組CTLA-4在Treg的蛋白表達(dá)也明顯高于Sham組(P<0.05)。
　　(7)與Sham組相比，CLP24h和48h組TLR4mRNA均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，以CLP48h組上升為著(P<0.01)。與Sham組比較，CLP24h和48h組TLR4蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且CLP48h組上調(diào)為著(

12、P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法建立的膿毒癥動(dòng)物模型，穩(wěn)定、可靠，適合后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　(2)采用兩步法免疫磁珠分離Treg細(xì)胞，所得細(xì)胞純度高，細(xì)胞活力無影響，完全可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。
　　(3)膿毒癥時(shí)Treg的功能與活性明顯增強(qiáng)，鑒于其免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用，提示Treg在膿毒癥免疫功能紊亂的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用：
　?、賂reg對(duì)Teff增殖抑制作用明顯增強(qiáng)；
　

13、　②Treg通過抑制促炎細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ等分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10等分泌，促使Th1/Th2平衡發(fā)生Th2偏移；
　?、勰摱景YTreg的凋亡明顯下降，以凋亡方式清除的Treg數(shù)量減少，提示發(fā)揮功能活性的Treg的數(shù)量增加；
　?、苡绊懞蜎Q定Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，以及Treg發(fā)揮接觸抑制效應(yīng)的重要膜分子CTLA-4的表達(dá)均明顯增加；
　　(4)Treg中TLR4的表達(dá)變