MiRo-1增加順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌細胞凋亡.pdf

1、目的：觀察 Miro-1蛋白在宮頸癌組織中的表達情況，并在順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細胞株-HeLa細胞的凋亡時，探討 Miro-1蛋白如何影響順鉑的生理學(xué)效應(yīng)。最終提供某些宮頸癌患者產(chǎn)生順鉑化療藥物的耐藥性科學(xué)理論依據(jù)，并判斷Miro-1是否可成為順鉑治療宮頸癌患者的新的生物學(xué)指標。
　　方法：利用 PCR擴增得到目的基因，載入到載體質(zhì)粒中，通過細胞免疫組化及共聚焦顯微鏡確定內(nèi)源性 Miro-1蛋白及過表達時，在細胞內(nèi)亞細胞器的定位。其次，

2、通過流式細胞儀觀察宮頸癌細胞株-HeLa細胞的死亡率及死亡的類型。利用蛋白印跡法確定PARP蛋白的切斷率，最終判斷過表達Miro-1蛋白可否增加順鉑誘導(dǎo)的HeLa細胞的凋亡率。最后利用流式細胞儀檢測線粒體膜通透性，并利用細胞免疫組化染色AIF蛋白,確定Miro-1蛋白如何增加細胞凋亡的機制。
　　結(jié)果：（1）亞細胞器定位實驗：通過細胞免疫組化實驗，觀察到內(nèi)源性Miro-1蛋白位于線粒體。同時利用 pEGFP-N1-Miro-1質(zhì)粒

3、與 pDsRed-Mito質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HeLa細胞，當過表達Miro-1蛋白，同樣可存在于線粒體內(nèi)。（2）通過流式細胞儀觀察細胞死亡率，發(fā)現(xiàn)隨著Miro-1蛋白表達，可增加順鉑誘導(dǎo)HeLa細胞的死亡率，提示 MiRo-1蛋白表達與細胞死亡呈正比，過表達 Miro-1蛋白24h及48h時，其細胞死亡率分別為24.2％和36.8%。（3）利用PI及Annexin V雙重染色法染色 HeLa細胞，并通過流式細胞儀檢測確定細胞死亡類型，發(fā)現(xiàn) M

4、iro-1蛋白可引起細胞凋亡。（4）利用流式細胞儀檢測線粒體膜通透性，發(fā)現(xiàn)當過表達Miro-1蛋白可增加線粒體膜的通透性，提示Miro-1蛋白可改變線粒體膜的完整性。（5）在HeLa細胞內(nèi)過表達Miro-1后，利用順鉑誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡，并進行AIF免疫染色，發(fā)現(xiàn)過表達Miro-1可增加AIF蛋白由線粒體溢出至細胞核，增加HeLa細胞的凋亡。
　　結(jié)論：在宮頸癌組織中 Miro-1蛋白表達水平下降，在宮頸癌細胞株-HeLa細胞中