小白菊內(nèi)酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬與凋亡作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的最主要的原因。目前在乳腺癌治療方面，手術(shù)治療，化學(xué)藥物治療，放射性治療及靶向治療都取得了很大的進(jìn)步。但是乳腺癌仍是影響女性健康的非常重要的原因。尋找新的治療手段和作用機(jī)制仍是十分重要的。在藥物研究中，倍半萜內(nèi)酯類化合物非常的受到關(guān)注，它們呈現(xiàn)出一系列的生物學(xué)活性，如抗癌，抗炎，抗菌，抗氧化等。而小白菊內(nèi)酯是從菊科植物中提取的倍半萜內(nèi)酯類化合物。許多年來(lái)，該植物主要用于治

2、療發(fā)熱，頭痛，關(guān)節(jié)炎等疾病。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)，從菊科植物中提取的倍半萜內(nèi)酯類化合物，小白菊內(nèi)酯對(duì)各種腫瘤都有一定的治療作用，如胰腺癌，前列腺癌，結(jié)腸癌，黑素瘤，膽管癌。同樣地，相關(guān)研究也已表明小白菊內(nèi)酯可抑制乳腺癌的進(jìn)展。但具體的作用機(jī)制仍需探討。自噬是被稱為第二種細(xì)胞程序性的死亡途徑，與凋亡有所不同。自噬可以通過(guò)溶酶體消除細(xì)胞內(nèi)的器官和蛋白。通常情況下，自噬水平是比較低的，只有在受到刺激或營(yíng)養(yǎng)缺乏等條件下，自噬水平升高。對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境

3、的穩(wěn)定，自噬過(guò)程是十分重要的。自噬過(guò)程如果無(wú)法發(fā)生，損傷的蛋白，器官無(wú)法消除而積累，正常的組織和器官則會(huì)處于有毒性的環(huán)境中，而影響其正常存活。細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白都受自噬途徑的影響，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)非常重要的機(jī)制。自噬在癌癥中所扮演的角色是非常復(fù)雜的?，F(xiàn)在研究認(rèn)為自噬是一把“雙刃劍”。腫瘤細(xì)胞通過(guò)自噬以適應(yīng)各種存活壓力，如癌基因、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腫瘤微環(huán)境、藥物作用等。另一方面，自噬過(guò)度激活也會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生程序性死亡?；诖松涎芯勘?/p>

4、景，探討小白菊內(nèi)酯是否可引起自噬以及所引起的自噬相關(guān)作用機(jī)制對(duì)于此種新型藥物對(duì)乳腺癌的影響是非常重要的。在乳腺癌細(xì)胞中，小白菊內(nèi)酯可引起乳腺癌細(xì)胞的自噬和凋亡的過(guò)程。研究指出抗癌藥物所引起的自噬過(guò)程可產(chǎn)生保護(hù)性的作用機(jī)制?；诖?，小白菊內(nèi)酯所引起的自噬過(guò)程的作用機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)于尋找新的治療機(jī)制是非常重要的。
　　方法：
　　在本論文中，主要通過(guò)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定小白菊內(nèi)酯的IC50劑量。采用集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定小白菊

5、內(nèi)酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。采用免疫熒光和自噬小體的形成來(lái)驗(yàn)證自噬過(guò)程的產(chǎn)生。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞凋亡的發(fā)生。采用western blot技術(shù)證實(shí)小白菊內(nèi)酯所引起自噬和凋亡過(guò)程的作用機(jī)制，觀察PI3K，AKT,phosphorylation ofAKT,mTOR，ATG13，ATG14的表達(dá)情況。同樣地，可以通過(guò)western blot技術(shù)在蛋白水平上探討B(tài)cl-2，Caspase-3，P62，和Beclin1的表達(dá)情況。RT-

6、qPCR在基因水平上觀察ATG13，ATG14的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖影響結(jié)果如下：其24h對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)率為96％，89.1％，80.1％，62.5％，47.3％，36.6％，29.5％，48h的抑制生長(zhǎng)率為90.6％，80.0％，66.3％，45.2％，34.5％，25.4％，18.7％。相比較之下，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)率就比較弱些，24

7、h的為96.3％，90.0％，81.3％，65.9％，50.9％，38.3％，30.1％，48h的抑制生長(zhǎng)率為89.4％，79.8％，67.3％，49.6％，34.2％，24.6％，19.7％。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步更為直觀的檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示處理組形成細(xì)胞集落的數(shù)量明顯低于對(duì)照組。
　　2.在MCF-7細(xì)胞中，經(jīng)藥物處理24小時(shí)之后，其藥物濃度為4μmol/L，8μmol/L，其凋亡率為1

8、2.66％和21.79％。在MDA-MB-231細(xì)胞中，其處理藥物濃度為5μmol/L，10μmol/L，凋亡率為12.24％，17.62％。Western blot結(jié)果顯示在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2表達(dá)水平降低，Caspase-3表達(dá)水平升高。
　　3.在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，經(jīng)小白菊內(nèi)酯該藥物處理過(guò)的細(xì)胞，經(jīng)MDC染色之后可以看到細(xì)胞內(nèi)自噬泡的熒光點(diǎn)狀分布。

9、采用Western blot技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)增高，P62表達(dá)降低。其次，采用免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)在實(shí)驗(yàn)組中Beclin-1水平表達(dá)增高。同樣地，采用免疫熒光技術(shù)和PCR技術(shù)，結(jié)果顯示：在實(shí)驗(yàn)組，ATG13，ATG14自噬相關(guān)基因高表達(dá)。
　　4.采用Western blot技術(shù)分別檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子在蛋