問號鉤體56609株基因組特征及鉤體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立.pdf

1、鉤體病是由致病性鉤體引起的世界范圍內(nèi)流行的人畜共患病。由于缺乏有效的遺傳操作手段，對鉤體及鉤體病的研究進(jìn)展一直比較緩慢。問號鉤體基因組只含有大小兩個染色體（CⅠ和CⅡ），沒有其它染色體外遺傳物質(zhì)存在。用高通量測序方法對56609株進(jìn)行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)56609株基因組中除染色體外，還可能含有3個質(zhì)粒（lcp1、lcp2和lcp3）。為了驗(yàn)證這3個質(zhì)粒為獨(dú)立于染色之外的復(fù)制子，本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測、原位脈沖場凝膠電泳(PFGE

2、)分離、Southern雜交等實(shí)驗(yàn)方法，成功證實(shí)染色體外質(zhì)粒的存在，同時還驗(yàn)證了質(zhì)粒的穩(wěn)定性，并通過PCR策略排除了其整合進(jìn)基因組的可能性。同時，應(yīng)用相似的實(shí)驗(yàn)方法，鑒定并糾正了56601株基因組中基因島LaiGI序列為染色體外質(zhì)粒Laicp，大小為64kb。
　　基于56609株中三個質(zhì)粒的復(fù)制起始域（rep及parAB基因）序列，在雙曲鉤體穿梭載體（L.biflex-E.coli）pGKBLe24的基礎(chǔ)上通過替換復(fù)制起始域而構(gòu)

3、建了三類不同的問號鉤體(L.interrogans-E.coli)穿梭載體，并運(yùn)用此載體成功轉(zhuǎn)化了雙曲PatocⅠ株、問號鉤體56606株和56610株，首次成功構(gòu)建了問號鉤體的復(fù)制型載體，為其遺傳操作研究奠定了基礎(chǔ)。
　　對同種致病性問號鉤體56609株、56601株及Fiocruz L1-130株的核酸序列進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)染色體上存在可能由可移動元件引起的基因組重排。56609株基因組比其它兩株大，除了含有3個特異的質(zhì)粒外，染色

4、體基因組中還存在大片段重復(fù)序列。對這三株菌的O抗原基因簇分析表明，由于56609株屬于流感傷寒群而56601株及Fiocruz L1-130株均屬于黃疸出血群，O抗原區(qū)基因簇序列有較大差異，在相似性很高的O抗原區(qū)基因簇序列中間存在一段菌株特異性基因序列，可以作為區(qū)分不同血清群的靶基因。
　　用絲裂霉素C對56609株進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)并通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，56609株能被誘導(dǎo)出噬菌體顆粒，通過RT-PCR及Real-Time PCR方