靶向Plk1 PBD新型抗腫瘤藥物先導化合物的發(fā)現(xiàn)與抗腫瘤機制研究.pdf

1、保羅樣激酶-1(Polo-likekinases1，Plk1)是廣泛存在于真核生物中的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。Plk1主要在細胞有絲分裂的G2晚期和M期表達，在有絲分裂啟動、中心體成熟、紡錘體組裝、染色體分離及胞質(zhì)分裂等細胞有絲分裂過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Plk1在大部分惡性腫瘤細胞中呈過度表達并且與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，被認為是腫瘤治療最具潛力的重要靶點。與Plk1功能相反，Plk2和Plk3被認為是重要的抑癌因子，在檢查點導致

2、的周期阻滯中發(fā)揮作用來保證基因組穩(wěn)定性，防止癌變。因此，小分子抑制劑對Plk1的高度選擇性是腫瘤靶向Plk1治療的關(guān)鍵問題。
　　Plk1-3的結(jié)構(gòu)具有較大的相似性，N端具有一個高度同源的激酶結(jié)構(gòu)域(kinasedomain，KD)即ATP結(jié)合域(ATP binding pocket)，C端具有調(diào)節(jié)Plk1催化活性及亞細胞動態(tài)定位的特征性結(jié)構(gòu)域PBD(Polo-Box domain，PBD)。由于ATP結(jié)合域在眾多激酶結(jié)構(gòu)中的高度

3、保守性及其結(jié)構(gòu)變異導致的耐藥問題，這使開發(fā)高選擇性的Plk1抑制劑面臨極大的挑戰(zhàn)。故此，Plk1特有的底物結(jié)合域PBD成為新型Plk1小分子抑制劑開發(fā)的理想靶點。
　　目前，已經(jīng)報道的Plk1 PBD小分子抑制劑主要包括Poloxin及其結(jié)構(gòu)類似物百里醌(Thymoquinone，TQ)、Poloxipan、紅倍酚（Purpurogallin，PPG）和綠茶兒茶素類化合物(Green Tea Catechins)。但是，這些數(shù)量及

4、結(jié)構(gòu)有限的小分子抑制劑多屬天然產(chǎn)物，極大地限制了靶向Plk1 PBD小分子抑制劑的基于結(jié)構(gòu)的定向設計。靶向Plk1 PBD的小分子抑制劑的開發(fā)對于Plk1 PBD生物學功能的研究以及靶向Plk1PBD新型抗腫瘤藥物的定向設計具有重要的理論和實際意義。
　　在本研究中，我們利用所建立的熒光偏振高通量篩選模型對本室化合物庫（含20，000個小分子化合物）進行高通量篩選，定向獲得靶向Plk1 PBD新型抗腫瘤藥物先導化合物—小分子抑制劑

5、T521。先導化合物T521為一類具有全新結(jié)構(gòu)的新型化合物，其為苯磺酰噁唑類化合物，本研究系本類化合物抗腫瘤活性的首次報道。小分子抑制劑T521對Plk1 PBD介導的GST-Map205PBM底物識別具有明顯的抑制作用，并且對Plk1 PBD具有較好的體外選擇性(Apparent IC50 PBD1≈1.22±0.13μM;Apparent IC50 PBD2,3＞500μM)。另外，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑T521對Plk1 PBD的抑

6、制作用具有明顯的時間依賴性和溫度依賴性，其與Plk1 PBD的結(jié)合為典型的“慢上慢下”的非共價鍵結(jié)合模式。上述這些性質(zhì)，與TQ和Poloxin與Plk1 PBD的結(jié)合模式極其相似。
　　在細胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑T521對12株腫瘤細胞具有明顯的細胞毒性，IC50值在1～5μM。但是，小分子抑制劑T521對MRC5、HEK-293和L02代表的正常細胞株的細胞毒性與腫瘤細胞的細胞毒性相比并沒有顯著差別，其IC50值在3～8

7、μM。上述數(shù)據(jù)表明，小分子抑制劑T521在體外對腫瘤細胞和正常細胞具有等同的細胞毒性。上述這種現(xiàn)象在BI2536、Poloxin及PPG中也有類似的相關(guān)報道。以流式細胞儀和Western Blot進行細胞周期阻滯分析中發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑T521可以明顯地使周期同步化的HeLa細胞發(fā)生劑量依賴性的G2/M期阻滯，延遲細胞周期進程。另外，小分子抑制劑T521可以明顯地干擾Plk1亞細胞定位，引發(fā)前中期細胞阻滯、中心體片段化、染色體整列損傷及

8、紡錘體組裝障礙。在AnnexinⅤ/PI雙染實驗及Western Blot實驗進行細胞凋亡分析中發(fā)現(xiàn)，小分子抑制劑T521可以明顯地引發(fā)HeLa細胞劑量依賴性的凋亡和PARP的大量斷裂。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑T521具有較好的抗腫瘤活性，其可以明顯地干擾Plk1亞細胞定位而抑制Plk1的生物學活性，引發(fā)前中期細胞阻滯、中心體片段化、染色體整列損傷及紡錘體組裝障礙，進而使HeLa細胞發(fā)生G2/M期阻滯和大量凋亡。本研究