新結(jié)構(gòu)抗腫瘤先導(dǎo)化合物Rasfonin的結(jié)合蛋白研究.pdf

1、活性小分子化合物，尤其是從植物、動(dòng)物和海洋生物中分離獲得的天然產(chǎn)物，因其生物學(xué)活性豐富多樣，是新藥發(fā)現(xiàn)中的重要來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)一種來(lái)源于青藏高原海拔4千米以上的真菌Doratomyces sp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物Rasfonin（由本研究所車(chē)永勝研究員課題組提供）進(jìn)行了系統(tǒng)的藥理學(xué)活性評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，Rasfonin對(duì)ras基因突變的腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，對(duì)K-ras突變的人源胰腺癌細(xì)胞Panc-1的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力

2、均有顯著的抑制作用。Rasfonin能夠顯著抑制CD1裸鼠Panc-1異體移植瘤的生長(zhǎng)。對(duì)Rasfonin初步的信號(hào)通路研究表明，它能夠通過(guò)下調(diào)Ras激活蛋白Sos1的表達(dá)來(lái)抑制Ras蛋白的活化，進(jìn)而抑制Ras-MAPK下游蛋白激酶的磷酸化。研究還考察了Rasfonin對(duì)包括Ras信號(hào)通路在內(nèi)的表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）信號(hào)通路相關(guān)的19種激酶活性的影響，結(jié)果表明，Ra

3、sfonin對(duì)其中大多數(shù)激酶活性均無(wú)明顯影響，僅對(duì)mTOR下游p70S6K的活性有明顯的上調(diào)作用。
　　Rasfonin抗腫瘤作用確切，它能夠通過(guò)下調(diào)Sos1蛋白的表達(dá)來(lái)抑制Ras蛋白的活化，進(jìn)而影響其下游MAPK蛋白激酶的磷酸化，現(xiàn)有的Ras抑制劑中尚未見(jiàn)同類(lèi)報(bào)道，Rasfonin有望成為抗腫瘤先導(dǎo)化合物，但其作用機(jī)制和靶標(biāo)尚不明確。本研究對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白進(jìn)行了研究。
　　新藥研究中，常用的靶標(biāo)方法可大致分為兩類(lèi)：從

4、信號(hào)通路、組學(xué)數(shù)據(jù)等表型數(shù)據(jù)進(jìn)行推導(dǎo)的正向方法和基于化合物與靶標(biāo)親和性結(jié)合的逆向方法。正向方法通過(guò)檢測(cè)經(jīng)小分子化合物處理后信號(hào)通路、基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、代謝物等的改變，找出小分子化合物的潛在靶標(biāo)；逆向方法則利用親和原理，直接分離小分子化合物的結(jié)合蛋白，更為直接。親和層析是利用化合物與靶蛋白的親和性結(jié)合而進(jìn)行靶標(biāo)分離的經(jīng)典的方法，通過(guò)將活性化合物固定于固相基質(zhì)表面，“釣取”其結(jié)合蛋白。該方法成功案例較多，如免疫抑制劑FK506的結(jié)合蛋白F

5、KBP12的發(fā)現(xiàn)、環(huán)孢菌素A的結(jié)合蛋白親環(huán)蛋白的發(fā)現(xiàn)、非甾體抗炎藥吲哚美辛的新結(jié)合蛋白乙二醛酶1（glyoxalase1，GLO1）的發(fā)現(xiàn)等。
　　盡管如此，小分子化合物溶解性差、與靶蛋白親和力弱等因素常會(huì)限制經(jīng)典親和層析的使用，近些年其改良方法不斷涌現(xiàn)。例如，針對(duì)高濃度的有機(jī)助溶試劑對(duì)體系產(chǎn)生的影響，Yamamoto等推出了系列親和層析法。該方法不需要設(shè)置陰性對(duì)照和競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照，是將蛋白樣品連續(xù)與多個(gè)固定了小分子化合物的層析柱孵育

6、，通過(guò)比較各層析柱留存蛋白的含量變化找出特異性的結(jié)合蛋白。針對(duì)經(jīng)典親和層析法中親和能力較弱的結(jié)合蛋白容易在洗脫過(guò)程中流失的問(wèn)題，可通過(guò)引進(jìn)光親和標(biāo)簽的方法，增強(qiáng)小分子化合物與靶蛋白的結(jié)合。
　　應(yīng)用親和層析這類(lèi)方法時(shí)由于需要將小分子化合物固定于固相載體表面，故通常需先對(duì)小分子化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，但結(jié)構(gòu)修飾過(guò)程往往會(huì)改變其活性。2009年美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊（Proceedings of the National Academy of

7、 Sciences，PNAS）報(bào)道了一種藥物靶標(biāo)辨識(shí)新技術(shù)——依賴(lài)于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS)。該技術(shù)利用小分子化合物能夠誘導(dǎo)結(jié)合蛋白構(gòu)象形態(tài)趨于穩(wěn)定、從而抵抗酶解作用的這一特性，從復(fù)雜的蛋白混合物中找到被小分子化合物保護(hù)的結(jié)合蛋白。DARTS也是基于藥物-靶標(biāo)的親和性結(jié)合，但具有不需對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的特點(diǎn)，甚至能夠進(jìn)行成分不明的復(fù)方藥物

8、的靶標(biāo)研究，為小分子化合物結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)提供了嶄新的思路和技術(shù)手段?，F(xiàn)已有一些研究者應(yīng)用DARTS成功獲得了潛在靶標(biāo)，例如，Randall等發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸能夠延長(zhǎng)成年秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的壽命，并運(yùn)用DARTS發(fā)現(xiàn)了它在此作用中的新蛋白質(zhì)靶標(biāo)——ATP合酶β亞基ATP5B；Molly等采用DARTS對(duì)葡萄籽提取物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了初步探究，獲得了GRP78等十余種可能的結(jié)合蛋白，為其進(jìn)一步靶標(biāo)研究提供了線(xiàn)索等。

9、　　本研究選擇了兩種能夠直接分離結(jié)合蛋白的方法——傳統(tǒng)的親和層析法和新技術(shù)依賴(lài)于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)（DARTS），對(duì)Rasfonin在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白進(jìn)行了探究，旨在獲得Rasfonin的結(jié)合蛋白，為其抗腫瘤作用靶標(biāo)和機(jī)制研究提供有效線(xiàn)索。
　　一、基于親和層析法對(duì)抗腫瘤先導(dǎo)化合物Rasfonin結(jié)合蛋白的研究
　　1. Rasfonin的生物素化修飾與活性檢測(cè)
　　由于親和層析法要求小分子化合物能夠被固定于固相

10、基質(zhì)，因此我們根據(jù)Rasfonin的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇了生物素-親和素系統(tǒng)作為連接媒介。本研究所車(chē)永勝研究員課題組對(duì)A304（Rasfonin）及其陰性對(duì)照物A321進(jìn)行了生物素化修飾。為了考察生物素化修飾是否改變了小分子的活性，我們采用CCK8法檢測(cè)了A304和A321及其生物素化衍生物A304-B、A321-B對(duì)K-ras基因突變的人胰腺癌細(xì)胞Panc-1細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明，A304對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，IC

11、50為9.07μM，與前期結(jié)果一致；A304-B的抑制趨勢(shì)與A304一致，IC50為9.5μM；A321對(duì)Panc-1細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯，IC50為19.3μM；但A321-B的IC50略有降低，為14.09μM。結(jié)果提示，A304修飾后活性未受到較大影響，可用于親和層析實(shí)驗(yàn)；而A321修飾后活性略有增強(qiáng)，可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.基于親和層析法對(duì)Rasfonin結(jié)合蛋白的搜尋
　　2.1.應(yīng)用經(jīng)典親和層析法對(duì)Ra

12、sfonin結(jié)合蛋白的搜尋
　　本研究首先采用鏈霉親和素瓊脂糖珠作為固相基質(zhì)對(duì) Rasfonin進(jìn)行了經(jīng)典親和層析，聯(lián)合聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)各組瓊脂糖珠結(jié)合的蛋白樣品進(jìn)行染色分析。為了排除非特異性結(jié)合蛋白的干擾，我們?cè)O(shè)置了陰性對(duì)照組和小分子競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組和競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照組相比，A304-B和A321-B處理組在分子量40～70kDa之間均可見(jiàn)三條差異條帶。
　　由于瓊脂糖珠

13、的孔徑較大，約45~165μm，容易吸附和潴留非特異性結(jié)合蛋白，導(dǎo)致背景較高，影響對(duì)結(jié)果的觀(guān)察；因此，本研究還選擇直徑僅2.8μm且顆粒均勻的磁珠為固相基質(zhì)進(jìn)行了Rasfonin結(jié)合蛋白的搜尋，在相似的分子量范圍內(nèi)也觀(guān)察到了五條差異條帶。
　　在經(jīng)典親和層析中，陰性對(duì)照組的作用并不明顯，可能與陰性對(duì)照物活性增強(qiáng)有關(guān)。為了彌補(bǔ)這一不足，同時(shí)也為了降低助溶有機(jī)試劑DMSO對(duì)體系的干擾，我們還采用改良方法系列親和層析進(jìn)行了Rasfoni

14、n結(jié)合蛋白的搜尋。實(shí)驗(yàn)中將蛋白樣品連續(xù)與兩個(gè)固定有A304-B的層析柱反應(yīng)（依次編號(hào)A304-B-1和A304-B-2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A304-B-1組與溶劑對(duì)照組和A304-B-2組相比，在35～70kDa分子量范圍內(nèi)出現(xiàn)了四條明顯的差異條帶。除35kDa的一組外，其余各組差異條帶的分子量范圍均與經(jīng)典親和層析法條帶位置相似。
　　2.2.親和層析法所得差異蛋白的質(zhì)譜鑒定與分析
　　綜合分析兩種親和層析法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇了

15、35～70kDa范圍內(nèi)分子量一致且有明顯差異的五組條帶（Rasfonin處理組的差異條帶與相應(yīng)位置處溶劑對(duì)照組的蛋白條帶為一組），采用納升液相電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜nanoLC進(jìn)行了檢測(cè)，并將蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在NCBI-nr Green Plants數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了Mascot檢索。檢索結(jié)果的匹配程度用得分值來(lái)體現(xiàn)，得分值越大匹配度越高，一般得分值高于200即表示檢索結(jié)果匹配良好，但當(dāng)?shù)梅种档陀?00時(shí)，若含有至少兩條較確定的特異性片段，也可認(rèn)為該

16、檢測(cè)結(jié)果可信。以此為依據(jù)，我們對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析，排除了匹配度較低以及在溶劑對(duì)照組中也出現(xiàn)的蛋白，發(fā)現(xiàn)了30種差異蛋白（即Rasfonin處理組中包含但溶劑對(duì)照組中不包含的蛋白）。對(duì)這些差異蛋白與腫瘤的相關(guān)性進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)DX39A、RBBP7等10種蛋白與腫瘤或相關(guān)信號(hào)通路存在密切聯(lián)系，可作為Rasfonin結(jié)合蛋白深入研究的線(xiàn)索。
　　二、基于依賴(lài)于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)（Drug Affinity Respons

17、ive Target Stability, DARTS）對(duì)抗腫瘤先導(dǎo)化合物Rasfonin結(jié)合蛋白的研究
　　1.DARTS的概念驗(yàn)證
　　DARTS利用小分子配體能夠使結(jié)合蛋白構(gòu)象形態(tài)更穩(wěn)定這一特性，通過(guò)觀(guān)察經(jīng)小分子和蛋白酶處理后蛋白樣品中受到小分子保護(hù)的蛋白含量變化，找出小分子的結(jié)合蛋白。為了驗(yàn)證DARTS原理的可行性，本研究參照文獻(xiàn)，選取經(jīng)DARTS驗(yàn)證成功的雷帕霉素及其高親和力靶蛋白FKBP12進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。SDS-P

18、AGE和Western Blotting檢測(cè)分析結(jié)果表明，在文獻(xiàn)所述條件下，與溶劑對(duì)照組相比，添加雷帕霉素的酶解組中FKBP12人源重組蛋白的水解程度明顯降低，條帶顯色增強(qiáng)，說(shuō)明雷帕霉素確實(shí)能從一定程度上保護(hù)FKBP12免受蛋白酶水解。
　　2.DARTS實(shí)驗(yàn)條件摸索
　　現(xiàn)已有多個(gè)研究小組應(yīng)用DARTS獲得了小分子化合物的靶標(biāo)或相關(guān)信息，但DARTS的具體實(shí)驗(yàn)條件仍有待于進(jìn)一步探索和優(yōu)化。本研究對(duì)DARTS中不同蛋白酶酶解

19、能力、蛋白酶濃度和酶解時(shí)長(zhǎng)等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了初步摸索。
　　2.1.不同種類(lèi)蛋白酶酶解能力的比較
　　我們根據(jù)文獻(xiàn)選擇了三種DARTS常用的廣譜蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、鏈霉蛋白酶），對(duì)其酶解能力進(jìn)行了比較。對(duì)工具細(xì)胞人源急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat非變性裂解提取的總蛋白室溫酶解15min，每種蛋白酶的濃度均由高到低設(shè)置（酶與蛋白質(zhì)量比）1:500、1:1000、1:2500、1:5000和1:1000

20、0五個(gè)梯度。結(jié)果表明，枯草桿菌蛋白酶作用劇烈，濃度1:500便幾乎將蛋白全部水解；嗜熱菌蛋白酶作用極弱，濃度1:500時(shí)僅可水解總蛋白的10％～20%；鏈霉蛋白酶作用相對(duì)柔和，在1:500～1:5000范圍內(nèi)約可水解總蛋白的30～60%。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示鏈霉蛋白酶1:500～1:5000的濃度范圍較適合DARTS。
　　2.2.不同濃度蛋白酶對(duì)DARTS結(jié)果的影響
　　結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果和文獻(xiàn)推薦條件，我們選擇作

21、用較溫和的鏈霉蛋白酶，以成功應(yīng)用DARTS找到新靶標(biāo)的α-酮戊二酸為研究對(duì)象進(jìn)行了總蛋白水平的實(shí)驗(yàn)，考察在相同酶解溫度、相同酶解時(shí)長(zhǎng)條件下，不同濃度鏈霉蛋白酶（1:500，1:1000，1:2500和1:5000）對(duì)DARTS結(jié)果的影響。結(jié)果表明，對(duì)于α-酮戊二酸，鏈霉蛋白酶濃度1:1000的條件下可觀(guān)察到的含量存在差異的蛋白條帶數(shù)目最多，差異條帶所在位置同原文獻(xiàn)結(jié)果基本一致；其它酶濃度條件下，由于酶解作用過(guò)弱或過(guò)強(qiáng)，差異條帶的呈現(xiàn)效果

22、均受到影響。結(jié)果提示，鏈霉蛋白酶濃度1:1000較適合DARTS中結(jié)合蛋白的顯現(xiàn)。
　　2.3.不同酶解時(shí)長(zhǎng)對(duì)DARTS結(jié)果的影響
　　在獲得了α-酮戊二酸DARTS最佳酶濃度（鏈霉蛋白酶濃度1:1000）的基礎(chǔ)上，本研究考察了不同酶解時(shí)長(zhǎng)（5、15、30min）對(duì)α-酮戊二酸DARTS結(jié)果的影響。結(jié)果表明，該酶濃度條件下，酶解5min明顯不足，并未觀(guān)察到差異條帶；酶解15min時(shí)，可觀(guān)察到的5個(gè)差異條帶，數(shù)目最多；酶解30

23、min時(shí)僅能觀(guān)察到一個(gè)不明顯的差異條帶。該結(jié)果提示，在鏈霉蛋白酶濃度為1:1000的條件下，酶解15min較適合DARTS結(jié)合蛋白的顯現(xiàn)。
　　2.4.DARTS優(yōu)化酶解條件的簡(jiǎn)單驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證優(yōu)化所得酶解條件（鏈霉蛋白酶1:1000、酶解15min）的可行性，我們選取靶標(biāo)已知、但未用DARTS驗(yàn)證過(guò)的小分子免疫抑制劑霉酚酸為研究對(duì)象，從人源重組蛋白和總蛋白兩個(gè)水平進(jìn)行了考察。
　　人源重組蛋白水平DARTS結(jié)果表

24、明，在鏈霉蛋白酶濃度1:1000、作用5min的條件下（由于人源重組蛋白純度較高，不存在無(wú)關(guān)蛋白的干擾，因此將酶解時(shí)間縮短至5min），與溶劑對(duì)照組相比，霉酚酸處理組的IMPDH1人源重組蛋白條帶被水解的程度減弱，顯色明顯增強(qiáng)，表明霉酚酸確實(shí)能保護(hù)其靶蛋白抵抗酶解。全蛋白水平DARTS結(jié)果表明，在鏈霉蛋白酶濃度1:1000、作用15min的條件下，可觀(guān)察到55～70kDa范圍內(nèi)有三條明顯的差異條帶。經(jīng)Western blotting檢測(cè)

25、，分子量55kDa處呈現(xiàn)含量變化的差異條帶中包含IMPDH1。
　　結(jié)果提示，前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得酶解條件（鏈霉蛋白酶1:1000、酶解15min）可操作性較強(qiáng)，可作為Rasfonin的DARTS研究的起步條件。
　　3.基于DARTS對(duì)Rasfonin結(jié)合蛋白的搜尋
　　3.1.應(yīng)用DARTS對(duì)Rasfonin結(jié)合蛋白的搜尋
　　參考前期優(yōu)化的DARTS條件，我們采用鏈霉蛋白酶1:1000的酶濃度，酶解時(shí)長(zhǎng)5～30

26、min，以工具細(xì)胞Jurkat總蛋白為蛋白原料，對(duì)Rasfonin進(jìn)行了DARTS總蛋白水平實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與DMSO溶劑對(duì)照組相比，Rasfonin10和100μM處理組在酶解5min和15min時(shí)，能夠明顯觀(guān)察到在40～55kDa分子量范圍內(nèi)有兩組較為明顯的差異條帶。將細(xì)胞更換為K-ras基因突變的人源胰腺癌細(xì)胞Panc-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到了一致的結(jié)果。與親和層析實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，差異條帶所出現(xiàn)的分子量范圍較一致，提示結(jié)合蛋白在40~

27、55 kDa范圍內(nèi)的可能性較大。
　　3.2.DARTS所得差異蛋白的質(zhì)譜鑒定與分析
　　運(yùn)用上述親和層析差異條帶的鑒定分析方法，我們對(duì)這兩組差異條帶進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定和Mascot分析。通過(guò)初步篩選，排除了匹配度較低以及在溶劑對(duì)照組中也出現(xiàn)的蛋白，共獲得了12種可信的差異蛋白。通過(guò)進(jìn)一步文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)其中YBOX1、AMPL、XPO2（CSE1L）等11種蛋白有與腫瘤相關(guān)的研究，可作為Rasfonin結(jié)合蛋白深入研究的線(xiàn)索

28、。
　　對(duì)于親和層析和DARTS所獲得的共21種可能的結(jié)合蛋白，進(jìn)一步的親和力篩選和功能驗(yàn)證工作仍在進(jìn)行中。
　　結(jié)論：
　　1.本課題建立了Rasfonin結(jié)合蛋白的研究技術(shù)平臺(tái)，包括傳統(tǒng)的親和層析法和靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)新技術(shù)DARTS兩個(gè)實(shí)驗(yàn)體系，并對(duì)新技術(shù)DARTS的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化；
　　2.應(yīng)用親和層析法對(duì)Rasfonin進(jìn)行了結(jié)合蛋白的搜尋，共發(fā)現(xiàn)了30種差異蛋白，并通過(guò)對(duì)蛋白相關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)其中有10種蛋

29、白與腫瘤或相關(guān)信號(hào)通路存在密切聯(lián)系，可作為Rasfonin結(jié)合蛋白深入研究的線(xiàn)索；
　　3.應(yīng)用DARTS對(duì)Rasfonin進(jìn)行了結(jié)合蛋白的搜尋，共發(fā)現(xiàn)了12種差異蛋白，并通過(guò)對(duì)蛋白相關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)其中有11種蛋白與腫瘤或相關(guān)信號(hào)通路存在密切聯(lián)系，可作為Rasfonin結(jié)合蛋白深入研究的線(xiàn)索。
　　綜上所述，本課題首次應(yīng)用傳統(tǒng)的親和層析法和靶標(biāo)研究新技術(shù)DARTS對(duì)抗腫瘤先導(dǎo)化合物Rasfonin進(jìn)行了結(jié)合蛋白的搜尋，共獲