淚液蛋白的定量分析及其臨床應(yīng)用.pdf

1、第一部分、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳加內(nèi)標(biāo)法定量分析淚液蛋白
　　 目的：許多眼部疾病伴有淚液蛋白的改變，定量分析淚液蛋白對我們進(jìn)一步了解這些眼部疾病起非常重要的作用。但由于只能從患者獲得微量的樣本，淚液蛋白的定量分析仍然是一個復(fù)雜的技術(shù)難題。本研究的目的是建立SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加內(nèi)標(biāo)定量分析微量淚液樣本中淚液蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法。
　　 方法：用淚液分泌試驗濾紙采集同一正常志愿者淚液。在15％

2、SDS-PAGE的凝膠上，用大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)作外標(biāo)蛋白或內(nèi)標(biāo)蛋白，結(jié)合光密度法分析，計算淚液總蛋白和淚液蛋白的主要成分。同時，用Bradford方法對淚液總蛋白進(jìn)行了測定。
　　 結(jié)果：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳加內(nèi)標(biāo)法測得的淚液總蛋白濃度為12.03±0.45 mg/ml，與用Bradford方法測得的結(jié)果一致(P＞0.05)。該方法能同時測定8個主要淚液蛋白條帶的含量，它們的含量分別為：2.26±0.07(18

3、.8％)，0.10±0.01(0.8％)，0.63±0.13(5.3％)，0.52±0.07(4.3％)，1.14±0.18(9.5％)，1.33±0.21(11.1％)，2.76±0.16(23.0％)，2.95±0.13 mg/ml(24.5％)，與用SBTI作外標(biāo)蛋白測得的結(jié)果無顯著差異。
　　 結(jié)論：成功建立SDS-PAGE加內(nèi)標(biāo)定量分析淚液蛋白的方法。以SBTI為內(nèi)標(biāo)蛋白，應(yīng)用SDS-PAGE結(jié)合光密度分析的方法，只需

4、要微量的樣本，就可以同時測定淚液總蛋白濃度及淚液中主要蛋白的含量。
　　 第二部分、 SDS-PAGE加內(nèi)標(biāo)法定量分析淚液蛋白的初步應(yīng)用
　　 目的：應(yīng)用SDS-PAGE加內(nèi)標(biāo)定量分析淚液蛋白的方法比較：毛細(xì)管與Schirmer試驗濾紙兩種采集淚液方法的差異；老年人與正常青年人淚液蛋白的差異。
　　 方法：用毛細(xì)管和淚液分泌試驗濾紙采集正常青年人和老年人的淚液。在15％SDS-PAGE的凝膠上，用SBTI作內(nèi)標(biāo)蛋

5、白，結(jié)合圖像分析，計算正常青年人和老年人的淚液總蛋白和淚液蛋白的主要成分。
　　 結(jié)果：比較兩種采集淚液的方法表明，濾紙采樣可導(dǎo)致第2條淚液蛋白條帶(對應(yīng)為血清白蛋白)含量增加，而另外5個主要淚液蛋白條帶的含量降低。青年人較老年人的淚液總蛋白含量高(P＜0.05)，且蛋白條帶分析顯示青年人淚液中的各個主要蛋白成分都較老年人的高。
　　 結(jié)論：應(yīng)用SDS-PAGE加內(nèi)標(biāo)法，只需要微量的樣本，就能準(zhǔn)確定量分析不同采樣方法、不

6、同年齡組的淚液蛋白之間存在的差異。該方法有望成為伴有淚液蛋白改變的疾病的診斷工具。
　　 第三部分、過敏性結(jié)膜炎患者淚液蛋白的定量分析及sPLA2-Ⅱa的變化
　　 目的：過敏性結(jié)膜炎患者常伴有淚膜的穩(wěn)定性下降，而淚液蛋白和淚液中的脂質(zhì)層在維持淚膜的穩(wěn)定性上起非常重要的作用。本研究應(yīng)用SDS-PAGE加內(nèi)標(biāo)法定量分析季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者與正常對照組之間淚液蛋白的差異。同時探討季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者淚液中

7、脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白Ⅱ A型分泌型磷脂酶A2(sPLA2-Ⅱa)有無變化。
　　 方法：對季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者和正常志愿者進(jìn)行問卷調(diào)查和常規(guī)眼部檢查。用淚液分泌試驗濾紙采集季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者和正常志愿者的淚液。應(yīng)用SDS-PAGE加內(nèi)標(biāo)法定量分析季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者與正常對照組的淚液蛋白。應(yīng)用免疫印跡法(Western Blot)的方法，檢測季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者和正常志愿者淚液中sPLA2-

8、Ⅱa的含量。
　　 結(jié)果：季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者的淚膜破裂時間比正常對照組明顯縮短。在比較季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者與正常對照組之間淚液蛋白的差異時，由于這兩組樣本保留了與結(jié)膜接觸的濾紙部分，其蛋白含量相對較高，電泳后顯示出更加多的蛋白條帶。我們總共分析了15個蛋白條帶的含量，發(fā)現(xiàn)季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者淚液的總蛋白濃度升高(P＜0.05)。其中蛋白條帶4，6，9的含量在季節(jié)性和常年性過敏性結(jié)膜炎患者淚液中升高