諾帝誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化的差異蛋白質(zhì)組初步研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤對人體危害大,治療困難,研究新型抗膠質(zhì)瘤藥物及其作用機(jī)制具有重要意義.在腫瘤治療學(xué)研究中,隨著維甲酸類對早幼粒細(xì)胞白血病治療的成功和機(jī)制的認(rèn)識,誘導(dǎo)分化已成為惡性腫瘤治療的新領(lǐng)域和研究熱點(diǎn).去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA) 是存在于常青灌木Larrea divaricata和Guaiacum officinale中的一種天然成分,是花生四烯酸代謝中脂氧化酶強(qiáng)烈而特異的抑制劑,具

2、有多種生物學(xué)功能.近年來的研究先后發(fā)現(xiàn)NDGA對多種實(shí)體瘤及體內(nèi)移植瘤等具有顯著的抑制作用.我們的既往研究結(jié)果顯示,NDGA對人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44在體內(nèi)和體外均具有顯著的抑制生長及誘導(dǎo)分化作用,并呈明顯的量-效和時-效關(guān)系:經(jīng)NDGA處理的瘤細(xì)胞貼壁率和生長速率受抑;細(xì)胞異型性變小,胞漿中膠質(zhì)細(xì)絲增多,并伴有線粒體的退變.同時,NDGA處理后細(xì)胞周期也有明顯改變,S期和G2/M期比例減少,多休止于Go/G1期;其CDK4、cy

3、clin D1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低,而P16基因的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加;NDGA還可通過下調(diào)bcl-2,c-myc基因表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡.我室依據(jù)這些結(jié)果,以創(chuàng)新路線人工合成出NDGA類化合物諾帝(Nordy),純度可達(dá)99﹪以上,并證明它具有抗惡性膠質(zhì)瘤作用,但機(jī)制尚未完全清楚.二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是目前惟一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的

4、分離技術(shù).為了探討諾帝誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化的作用機(jī)制,尋找其作用的靶蛋白和(或)效應(yīng)分子,本文采用2-DE方法比較諾帝處理前后不同惡性程度的三種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44、CHG-5、U87-MG的蛋白質(zhì)組改變,并采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定其中的部分蛋白質(zhì),為進(jìn)一步研究這些蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)分化機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ).主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.用不同劑量的諾帝分別處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44、CHG-5、U87-MG 24小時后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變

5、,細(xì)胞異型性變小,表現(xiàn)為核漿比例變小,核分裂相減少,細(xì)胞突起增多變長;處理72小時后更為明顯,并且200μmol/L諾帝較之100μmol/L的諾帝作用更為明顯.結(jié)果證明,諾帝對不同惡性程度的膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有誘導(dǎo)分化作用,呈現(xiàn)時-效和量-效依賴性.2.采用200μmol/L諾帝處理72小時后的SHG-44、CHG-5、U-87MG三種細(xì)胞系及其相應(yīng)的空白對照組細(xì)胞,分別裂解后提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)Lowry法定量后取每種細(xì)胞的處理組及其相應(yīng)

6、的空白對照組蛋白行二維凝膠電泳.采用固相IPG膠條(pH3-10,13cm)等電聚焦,12.5﹪的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)0.1﹪考馬斯亮藍(lán)染色后獲得清晰的蛋白電泳圖譜.采用PDQuest7.1軟件分別對每種細(xì)胞的處理組及其相應(yīng)的空白對照組圖譜進(jìn)行數(shù)字化量化分析,結(jié)果顯示,SHG-44細(xì)胞諾帝處理組有698±125個蛋白點(diǎn)(n=3),重復(fù)率為81.2﹪; 相應(yīng)的空白對照組有571±227個蛋白點(diǎn)(n=3),重復(fù)率為73.5﹪;具有顯

7、著差異(p<0.05)的蛋白點(diǎn)為23個,其中21個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào),2個蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào).CHG-5細(xì)胞諾帝處理組有712±136個蛋白點(diǎn)(n=3),重復(fù)率為83.7﹪;相應(yīng)的空白對照組有590±211個蛋白點(diǎn)(n=3),重復(fù)率為73.6﹪;具有顯著差異(p<0.05)的蛋白點(diǎn)為18個,其中9個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào),9個蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào).U-87MG細(xì)胞諾帝處理組有615±76個蛋白點(diǎn)(n=3),重復(fù)率為85.8﹪;相應(yīng)的空白對照組有630±87個

8、蛋白點(diǎn)(n=3),重復(fù)率為81.5﹪;具有顯著差異(p<0.05)的蛋白點(diǎn)為41個,其中38個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào),3個蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào).上述結(jié)果提示,諾帝誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化過程中以抑制瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)為主.3.將2-DE結(jié)果中部分高表達(dá)差異蛋白行MALDI-TOF-MS鑒定,結(jié)果顯示以下蛋白質(zhì):①一種與actin有同源性的未命名蛋白.②cofilin1.③增殖相關(guān)基因A(proliferation-associated gene A).④磷酸

9、甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1).⑤β半乳糖苷酶結(jié)合凝集素(beta galactoside binding lectin).⑥交替拼接因子3(alternative splicing factor ASF-3).這些蛋白質(zhì)在諾帝誘導(dǎo)SHG-44、CHG-5、U87-MG三種不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化后均下調(diào)表達(dá).此外,SHG-44細(xì)胞中Up1也表達(dá)下調(diào).但諾帝處理后上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)在三種細(xì)胞中則不盡相同,

10、SHG-44細(xì)胞谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)表達(dá)上調(diào);CHG-5細(xì)胞環(huán)孢素A受體(cyclophilin)表達(dá)上調(diào);U87-MG細(xì)胞則甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase )和α烯醇化酶(alpha enolase)表達(dá)上調(diào).結(jié)合這些下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)資料分析,推測諾帝誘導(dǎo)分化所導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制及凋亡等系增殖相關(guān)基因A (pr

11、oliferation-associated gene A)和磷酸甘油酸激酶 1(phosphoglycerate kinase 1)表達(dá)下調(diào)所致.而諾帝誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化所引起的細(xì)胞骨架聚合、細(xì)胞貼壁率下降則是由一種與actin同源的未命名蛋白及cofilin1表達(dá)下調(diào)所致.其它如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)、環(huán)孢素A受體(cyclophilin)、甘油醛三磷酸脫氫酶(glyceraldehy