趨化因子CXCL12及受體CXCR4與卵巢上皮性癌生長與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、卵巢惡性腫瘤占女性全身腫瘤死因順位的第五位，在婦科腫瘤中占首位。人類卵巢上皮性癌占卵巢惡性腫瘤的90％，其5年生存率僅為25％-30％，因此卵巢上皮性癌(以下簡稱卵巢癌)是婦科腫瘤領(lǐng)域威脅女性生命的第一殺手。卵巢癌獨特的生長和轉(zhuǎn)移規(guī)律是廣泛地轉(zhuǎn)移至腹膜、隔膜和大網(wǎng)膜，最終由于盆、腹腔的廣泛播散而導(dǎo)致患者死亡。因此卵巢癌治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移播散。探索腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制對改善病人預(yù)后至關(guān)重要。但腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)分子，如生長因子

2、、粘附因子、化學(xué)吸引分子一直不被人們認識。2001年Muller等對乳腺癌和黑色素瘤進行了一系列趨化因子及其受體的研究，使人們認識到癌細胞的趨化性轉(zhuǎn)移可能受CXCL12-CXCR4軸調(diào)節(jié)。以前研究證實趨化因子CXCL12及其受體CXCR4調(diào)節(jié)白細胞的遷移和造血干細胞的歸巢。在腫瘤組織中表達最普遍為CXCR4。本課題是從臨床到基礎(chǔ)，層次遞進的系列研究，包括CXCL12和CXCR4表達的臨床意義、細胞體外實驗和體內(nèi)動物實驗，旨在探討CXCL

3、12和CXCR4表達與臨床病理特征、腫瘤惡性侵襲行為和預(yù)后的關(guān)系，以及CXCL12-CXCR4軸對腫瘤轉(zhuǎn)移過程中多個重要步驟的影響和CXCR4拮抗劑AMD3100對體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用，從而加深對卵巢癌生物學(xué)行為的理解，為CXCR4抑制劑用于卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。 方法：課題分為三部分： 1趨化因子CXCL12及受體CXCR4在卵巢上皮性癌組織中的表達及其臨床意義。采用免疫組化SP法檢測6例正常卵巢表面上皮、17例

4、良性上皮性卵巢腫瘤、10例交界性上皮性卵巢腫瘤、44例卵巢上皮性癌原發(fā)灶和30例相應(yīng)大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶組織中的CXCL12和CXCR4蛋白表達。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測12例上述卵巢上皮性癌原發(fā)灶組織的CXCL12和CXCR4mRNA表達，以及5例正常腹膜和12例卵巢癌腹膜的CXCL12mRNA表達。分析卵巢上皮性癌組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達與患者年齡、腫瘤病理類型、手術(shù)病理分期、病理分化、術(shù)后殘余灶大小、

5、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水、CA125下降等臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系。 2CXCL12-CXCR4軸對卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲和分泌的體外實驗研究。人卵巢腺癌細胞株CAOV-3、3AO和SKOV3細胞體外培養(yǎng)。采用免疫細胞化學(xué)染色法檢測3種細胞CXCR4蛋白表達，采用RT-PCR技術(shù)檢測3種細胞CXCL12和CXCR4mRNA表達。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法，判斷在無血清培養(yǎng)液的生長條件下，不同濃度的CXCL12對CAOV-3和3

6、AO細胞增殖的影響，以及CXCR4中和抗體或拮抗劑AMD3100的抑制作用。以Transwell侵襲小室為模型，應(yīng)用Matrigel探討不同濃度的CXCL12和腹水對CAOV-3和3AO細胞遷移、侵襲的影響，以及CXCR4中和抗體或拮抗劑AMD3100對此的抑制作用。采用RT-PCR技術(shù)判斷CAOV-3和3AO細胞整合素β1和VEGF-CmRNA表達，以及CXCL12作用后不同時間兩者的變化。 3荷人卵巢癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型

7、的建立及實驗。人卵巢腺癌細胞株CAOV-3體外培養(yǎng)。將裸鼠分為A、B兩組。1×107CAOV-3細胞接種于裸鼠左肋背部皮下，3小時后A組腹腔注入CXCR4拮抗劑AMD3100。2周左右待移植瘤長徑達0.7-1cm時，將B組隨機分為B1和B2兩組，B1組腹腔內(nèi)注入PBS，B2組腹腔注入AMD3100，觀察三組移植瘤體積的變化，計算抑瘤率。 結(jié)果： 1正常卵巢表面上皮細胞無CXCL12和CXCR4蛋白表達，但兩者共表達在卵巢

8、皮質(zhì)的卵泡細胞。17例卵巢良性上皮性腫瘤CXCL12和CXCR4蛋白陽性率分別為100％和88％；10例卵巢交界性上皮性腫瘤CXCL12和CXCR4蛋白陽性率均為90％，在卵巢良性和交界性上皮腫瘤中CXCL12陽性細胞為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，CXCR4為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。正常腹膜有CXCL12mRNA表達，其表達量與癌腹膜相近，顯著低于癌組織(P＜0.05)。12例卵巢上皮性癌組織均有CXCL12(1.13±0.12)和CXCR4(

9、0.9±0.1)mRNA表達，44例卵巢上皮性癌原發(fā)灶的CXCL12和CXCR4蛋白表達陽性率分別為91％和59％。CXCL12陽性細胞為細胞質(zhì)著色；在26例CXCR4陽性表達腫瘤中，僅1例為細胞核著色，其余為細胞質(zhì)著色。原發(fā)灶的CXCR4表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但將原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的CXCR4表達相結(jié)合，CXCR4表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P=0.018)。CXCL12表達強度與術(shù)中腹水量呈顯著相關(guān)(P=0.014)。難治復(fù)發(fā)組的CX

10、CR4陽性率(81％)顯著高于無復(fù)發(fā)組(28％，P=0.001)。單因素分析顯示：CXCR4陽性表達的患者中位數(shù)腫瘤無進展生存時間和總生存時間(15個月、27個月)明顯短于CXCR4陰性表達者(＞21個月、＞32個月，分別為P＜0.001和0.017)。多因素分析顯示：CXCR4表達和殘余灶大小是影響卵巢上皮性癌患者腫瘤無進展生存時間和總生存時間的獨立預(yù)后因素。 2CAOV-3卵巢癌細胞有CXCR4mRNA和蛋白表達，無CXCL

11、12mRNA表達。在100ng/mlCXCL12作用下，CXCR4mRNA表達顯著增加(P＜0.05)。3AO細胞有極弱的CXCR4mRNA和蛋白表達。在無血清的亞最佳生長條件下，培養(yǎng)第1、2、3天，100ng/mlCXCL12可明顯刺激CAOV-3和3AO細胞的增殖(P＜0.05)，而10ng/mlCXCL12對CAOV-3和3AO細胞的增殖與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)；100ng/mlCXCL12對細胞的增殖作用能被10u

12、g/mlCXCR4中和抗體或1ug/mlAMD3100所抑制；在沒有CXCL12的作用下，單純的10ug/mlCXCR4中和抗體不能抑制細胞的增殖。CXCL12對CAOV-3和3AO細胞的遷移有明顯的趨化性，隨CXCL12濃度的增加遷移的細胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，并被10ug/mlCXCR4中和抗體或1ug/mlAMD3100所抑制。腹水對CAOV-3細胞的遷移作用顯著強于CXCL12(P＜0.05)，并不被CXCR4中和抗體和V

13、EGF中和抗體所抑制。CXCL12對3AO細胞的遷移作用程度小于CAOV-3細胞。在無血清培養(yǎng)液作為對照時，CAOV-3穿過Matrigel的細胞數(shù)很少；10ng/mlCXCL12使CAOV-3穿過Matrigel的細胞數(shù)增多(P＜0.05)，100ng/mlCXCL12使CAOV-3穿過Matrigel的細胞數(shù)顯著增多，其水平超過10ng/mlCXCL12(P＜0.05)，表明隨CXCL12濃度增加細胞侵襲性增強，這種侵襲能被10ug

14、/mlCXCR4中和抗體或1ug/mlAMD3100抑制。卵巢癌腹水使CAOV-3穿過Matrigel細胞明顯增多，其水平超過100ng/mlCXCL12(P＜0.05)，并且不被CXCR4中和抗體和VEGF中和抗體所抑制。CXCL12不能促進3AO細胞穿過Matrigel。CAOV-3細胞有整合素β1(0.534±0.1)和VEGF-CmRNA(0.524±0.09)表達。100ng/mlCXCL12作用后3小時整合素β1mRNA表達

15、顯著增加(1.527±0.16)(P＜0.05)，24小時維持高水平。100ng/mlCXCL12作用后8小時VEGF-CmRNA表達開始增多(0.803±0.1)，24小時顯著增加(1.107±0.15)(P＜0.05)。3AO細胞無VEGF-C和整合素β1mRNA表達，CXCL12作用后24小時內(nèi)未能誘導(dǎo)VEGF-C和整合素β1mRNA表達。 3B1組(對照組)裸鼠皮下移植瘤生長速度最快。實驗結(jié)束時，A組(成瘤前腹腔注入AM

16、D3100)移植瘤體積顯著小于B1和B2(成瘤后腹腔注入AMD3100)組(P＜0.01)，B1組移植瘤體積顯著大于B2組(P＜0.01)。B2組抑瘤率為66.11％。B1組移植瘤表面充血，新生血管生成明顯。 結(jié)論：CXCR4在卵巢上皮性癌中的表達陽性率較高，是影響其預(yù)后的獨立指標(biāo)之一。體外實驗證實CXCL12可促進細胞的增殖、遷移、侵襲、分泌整合素β1和VEGF-C，并被CXCR4中和抗體或拮抗劑AMD3100抑制，表明CXC