趨化因子受體CXCR4表型敲除抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、本課題首次采取細(xì)胞內(nèi)趨化因子突變體策略，構(gòu)建含有SDF-1的突變體SDF-1α/54 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位片段KDEL的嵌合基因的重組真核表達(dá)載體和腺病毒表達(dá)載體，其表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)趨化因子突變體SDF-1α/54/KDEL 蛋白可在細(xì)胞內(nèi)與同時(shí)與新合成的靶受體CXCR4產(chǎn)生特異性結(jié)合，并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成復(fù)合物，隨后被泛素蛋白等途徑分解。抑制CXCR4在細(xì)胞表面的表達(dá)，從而阻止了CXCR4/SDF-1與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的通路，研究結(jié)果將為探究以CXC

2、R4為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： ①采用 RT-PCR 等方法從健康成人骨髓組織中克隆人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(hSDF-1)野生型成熟肽編碼序列(SDF-1wt)，定向插入原核克隆表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)，構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)。以此為基礎(chǔ)進(jìn)行刪除C末端結(jié)構(gòu)域的缺失突變，為實(shí)施細(xì)胞內(nèi)趨化因子突變體提供物質(zhì)基礎(chǔ)； ②構(gòu)建人SDF-1α細(xì)胞內(nèi)趨化因子突變體SDF-1α/54/KDEL 的重組真核表達(dá)質(zhì)

3、粒，并考察其對(duì)T細(xì)胞性白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞表面受體CXCR4表達(dá)的影響，及對(duì)細(xì)胞趨化和生長(zhǎng)的影響，為表型敲除腫瘤細(xì)胞表面受體 CXCR4 以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)； ③構(gòu)建攜帶含細(xì)胞內(nèi)趨化因子突變體 SDF-1α/54/KDEL 基因片段的重組腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL,考察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的CXCR4表型敲除效應(yīng)，及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、趨化和侵襲作用的影響； ④建立在裸鼠體內(nèi)腫

4、瘤細(xì)胞高表達(dá) CXCR4 的乳腺癌動(dòng)物模型，為后續(xù)考察重組腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL 對(duì)CXCR4 表型敲除作用和荷瘤小鼠腫瘤的影響奠定基礎(chǔ)。 方法： ①采用RT-PCR從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞克隆野生型hSDF-1wt基因并進(jìn)行缺少突變產(chǎn)生 C 端α-螺旋結(jié)構(gòu)域缺失的 hSDF-1α/54 基因，將二者直接插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，構(gòu)建hSDF-1wt和hSDF-1α/54 的原核表達(dá)系統(tǒng)后，轉(zhuǎn)化大腸

5、桿菌表達(dá)BL21(DE3)，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 ②以SDF-WT-PET30a (+)重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增SDF-1α/54基因，并在其C末端引入對(duì)應(yīng)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)序列4肽KDEL的編碼基因序列，形成細(xì)胞內(nèi)趨化因子突變體SDF-1α/54/KDEL。隨后將其亞克隆至真核克隆/表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Myc-His(-)A 和 pEGFP-C3，構(gòu)建出兩組重組表達(dá)質(zhì)粒：pcDNA3.1/SDF-1α/54/KDEL

6、和 pEGFP/SDF-1α/54/KDEL。測(cè)序正確的重組子經(jīng)提取質(zhì)粒和純化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 Cos-7 細(xì)胞，用 Western blot 鑒定突變體SDF-1α/54/KDEL 的功能性表達(dá)，并用激光共聚焦顯微鏡觀察SDF-1/54α/KDEL的融合蛋白在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的定位情況。然后用電穿孔法將經(jīng)質(zhì)粒大量提取并純化的重組體pcDNA3.1/SDF-1α/54/KDEL和pEGFP/SDF-1α/54/KDEL，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Molt-

7、4 后，用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞膜表面CXCR4含量的變化。FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 Molt-4 生長(zhǎng)情況，趨化性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDF-1α/54/KDEL轉(zhuǎn)染后對(duì)Molt-4表面受體CXCR4的影響。 ③應(yīng)用PCR的方法制備含 SDF-1α/54/KDEL基因的 DNA 片段，分別雙酶切SDF-1α/54/KDEL 和空的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV,再將二者連接，將SDF-1α/54KDEL 亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒載體，構(gòu)建成

8、pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL，再利用宿主細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法將其與E1缺失的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，構(gòu)建成重組腺病毒質(zhì)粒 Ad-SDF-1α/54/KDEL。鑒定正確后，利用Lipofectamine 2000介導(dǎo)將腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL感染細(xì)胞轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，大約 7 天出現(xiàn)病毒空斑。提取重組感染腺病毒的 293 細(xì)胞的 mRNA 進(jìn)行SDF-1α/54/KDEL基因轉(zhuǎn)

9、錄的 RT-PCR 鑒定，并配合 GFP 表達(dá)鑒定觀察SDF-1α/54/KDEL蛋白的表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞傳代收獲大量擴(kuò)增的重組腺病毒，測(cè)定重組腺病毒的感染復(fù)數(shù)(MOI)值。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定Ad-SDF-1α/54/KDEL的表型敲除活性：流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞膜 CXCR4 變化情況；MTT法考察Ad-SDF-1α/54/KDEL對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 增殖作用的影響；趨化性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ad-SDF-1α/54/KDEL對(duì)MCF-7細(xì)胞的趨化活

10、性的影響；明膠酶譜和侵襲實(shí)驗(yàn)探索重組腺病毒的Ad-SDF-1α/54/KDEL對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響。 ④通過(guò)裸鼠皮下脂肪墊移植高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 建立乳腺癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，檢測(cè)荷瘤小鼠原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤各組織的SDF-1α和CXCR4的表達(dá)情況，為考察Ad-SDF-1α/54/KDEL表型敲除CXCR4對(duì)乳腺癌的轉(zhuǎn)移的影響作好準(zhǔn)備。 結(jié)論： ①克隆了出人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(hSDF-1)基

11、因，并通過(guò)基因缺失突變刪除了C末端α螺旋結(jié)構(gòu)域，獲得了突變體SDF-1α/54，并構(gòu)建了其大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。 ②以真核克隆/表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)A和pEGFP-C3為基礎(chǔ)構(gòu)建的兩種重組真核表達(dá)載體在 Cos-7 細(xì)胞表達(dá)SDF-1α/54/KDEL，具有在基因水平實(shí)施CXCR4表型敲除的功能，并能抑制Molt-4細(xì)胞的趨化性且不影響該細(xì)胞的生長(zhǎng)。表型敲除效率不受SDF-1αC末端α螺旋結(jié)構(gòu)域缺失的影響。

12、其可能機(jī)制是：轉(zhuǎn)染后合成的SDF-1α/54/KDEL新蛋白，運(yùn)至高爾基復(fù)合體時(shí)由于KDEL的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位作用，新蛋白不會(huì)向細(xì)胞膜運(yùn)轉(zhuǎn)而分泌到細(xì)胞外，而是滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。由于SDF-1α/54/KDEL保留了與 CXCR4 結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)，仍具備識(shí)別和結(jié)合 CXCR4受體的能力。SDF-1α/54/KDEL 蛋白便可以在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合新合成的或內(nèi)在化的CXCR4 形成復(fù)合物，隨后被泛素．蛋白酶體等途徑降解，從而抑制了受體CXCR4在細(xì)胞膜上的表

13、達(dá)，達(dá)到了表型敲除的效果。 ③重組腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL 能夠在乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7 中感染和表達(dá)、滴度高、增殖快、作用高效、毒副作用小，具有對(duì)MCF-7 受體CXCR4表型敲除的作用。通過(guò)感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，表型敲除的效應(yīng)較重組真核表達(dá)載體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并能在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的趨化和侵襲性。其表型敲除機(jī)制可能與前述真核表達(dá)質(zhì)粒相同，推測(cè)其具有抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。 ④通過(guò)裸鼠皮下脂肪墊移