趨化因子CXCL16及其受體CXCR6維持CD133+卵巢癌干細(xì)胞侵襲遷移能力的研究.pdf

1、研究背景:
　　盡管科研人員投入了大量精力及研究經(jīng)費(fèi)，卵巢癌仍然是一個(gè)非常致命的疾病。到目前為止，尚無早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌的有效篩查方法，大多數(shù)患者被診斷出癌癥時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前治療卵巢癌的主要方法是減瘤根治術(shù)及術(shù)后鉑類和紫杉醇的化療。較新療法包括分子靶向治療和腹膜內(nèi)化療可以稍延長(zhǎng)生存時(shí)間，但大多數(shù)患者最終愈后不良。術(shù)前就已經(jīng)轉(zhuǎn)移和術(shù)后化療抵抗及復(fù)發(fā)是治療卵巢癌的主要問題。研究卵巢癌化療抵抗及轉(zhuǎn)移的具體途徑和機(jī)制對(duì)患者意義重大，會(huì)使患者

2、的治療效果得到顯著改善。在許多惡性腫瘤中，都存在一個(gè)亞群的腫瘤細(xì)胞，只占極低比例，但是能決定腫瘤的發(fā)生發(fā)展，稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)。這些CSCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及術(shù)后化療抵抗的根本原因。趨化因子結(jié)合到相應(yīng)受體激活下游信號(hào)通路后參與腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移。最近研究表明，趨化因子可以刺激CSCs上特異受體激活相關(guān)通路從而促進(jìn)其自我更新和侵襲轉(zhuǎn)移。比如表達(dá)CXCR1的乳腺癌干細(xì)胞與CXCL8結(jié)合后維持自我

3、更新和侵襲能力;CD133+CXCR4+CSCs是胰腺癌轉(zhuǎn)移不可或缺的因素;CXCR4+腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在其配體CXCL12的趨化下啟動(dòng)了膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果表明，CSCs參與的腫瘤轉(zhuǎn)移部分是通過趨化因子介導(dǎo)，因此CSCs的轉(zhuǎn)移潛能是可能被抑制的。迄今為止，科學(xué)家已證明存在CD133+卵巢腫瘤干細(xì)胞(ovarian cancer stemcells，OCSCs)，并分別從病人腫瘤、腹水及細(xì)胞株中成功分離出OCSCs。但是何種因子維持

4、OCSCs自我更新及侵襲遷移能力尚未可知，本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已從卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780中成功分離、鑒定出OCSCs，通過PCR-array檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OCSCs相對(duì)于CD133-非卵巢癌干細(xì)胞(non ovarian cancer stem cells，nOCSCs)高表達(dá)趨化因子CXCL16及其受體CXCR6?；谝陨涎芯?，我們?cè)O(shè)想OCSCs可能通過自分泌CXCL16結(jié)合到CXCR6維持其生物學(xué)行為，本研究將對(duì)OCSCs的針對(duì)性治療策

5、略提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.比較CXCL16和CXCR6在CD133+OCSCs和CD133-nOCSCs之間的表達(dá)差異
　　2.探討CXCL16/CXCR6軸在CD133+OCSCs增殖及侵襲遷移中的作用
　　方法:
　　1.Real-time PCR檢測(cè)OCSCs與nOCSCs中CXCL16及CXCR6在mRNA水平的表達(dá)差異。
　　2.ELISA檢測(cè)OCSCs與nOCSCs中CXCL1

6、6在蛋白水平的表達(dá)差異。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OCSCs與nOCSCs細(xì)胞表面CXCR6的陽性率。
　　4.CCK-8法檢測(cè)中和抗體阻斷CXCL16后OCSCs增殖能力的變化。
　　5.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中和抗體阻斷或shRNA沉默CXCL16后OCSCs侵襲遷移能力的變化。
　　6.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中和抗體阻斷CXCR6后OCSCs侵襲遷移能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.OCS

7、Cs較nOCSCs高表達(dá)CXCL16 mRNA(4.59±0.73)倍，高表達(dá)CXCR6mRNA（18.24±0.77）倍(P＜0.01)。
　　2.OCSCs的CXCL16分泌量為（2434.00±204.65）ng/ml，而nOCSCs的CXCL16分泌量為（129.33±31.64）ng/ml，(P＜0.01)。
　　3.OCSCs表面CXCR6表達(dá)率為（60.6±5.3）％，而nOCSCs只有（6.4±1.6）％，(

8、P＜0.01)。
　　4.CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，當(dāng)OCSCs分泌的CXCL16被中和抗體阻斷后，OD(450)值在96h內(nèi)無明顯差異(P＞0.05)。
　　5.CXCL16中和抗體阻斷實(shí)驗(yàn):遷移細(xì)胞數(shù):對(duì)照組為(43.00-4.00)個(gè)/視野，CXCL16中和抗體組為（21.33±3.06）個(gè)/視野(P＜0.01)。侵襲細(xì)胞數(shù):對(duì)照組為(44.58±4.51)個(gè)/視野，CXCL16中和抗體組為(18.00±4

9、.00)個(gè)視野(P＜0.01)。
　　CXCL16-shRNA沉默實(shí)驗(yàn):遷移細(xì)胞數(shù):對(duì)照shRNA組為(59.33±2.52)個(gè)/視野，CXCL16-shRNA組為(28.00±3.00)個(gè)/視野，(P＜0.01)。侵襲細(xì)胞數(shù):對(duì)照shRNA組為(63.67±3.51)個(gè)/視野，CXCL16-shRNA組為(28.67±4.04)個(gè)/視野，(P＜0.01)。
　　6.CXCR6中和抗體阻斷實(shí)驗(yàn):遷移細(xì)胞數(shù):對(duì)照組為(64.6

10、7±4.16)個(gè)/視野，CXCR6中和抗體組為(33.17±5.03)個(gè)/視野，(P＜0.01)。侵襲細(xì)胞數(shù):對(duì)照組為(55.67±3.51)個(gè)/視野，CXCR6中和抗體組為(24.33±4.04)個(gè)/視野，(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.相對(duì)于nOCSCs，OCSCs在基因水平和蛋白水平都高表達(dá)CXCL16及CXCR6。
　　2.趨化因子CXCL16不影響OCSCs的增殖能力。
　　3.CD133+卵巢