單引物PCR擴(kuò)增效率及甘藍(lán)型油菜Toc33基因啟動(dòng)子的分離.pdf

1、單引物PCR是一種只用一條引物就可以克隆已知序列側(cè)翼未知區(qū)域的染色體步移方法。它利用引物在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下會(huì)與模板發(fā)生錯(cuò)配結(jié)合的特性，使一端引物與已知序列退火，而另一端引物則與未知側(cè)翼區(qū)的部分相似序列退火來實(shí)現(xiàn)完整的PCR擴(kuò)增。為了研究引物的長(zhǎng)短對(duì)擴(kuò)增效率的影響，分別設(shè)計(jì)了三組長(zhǎng)為6、8、10堿基的短引物以及一組19和22堿基的長(zhǎng)引物，以甘藍(lán)型油菜基因組DNA為模板進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增，用電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物并割膠回收較明亮的條帶，再用巢式PC

2、R鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物和回收產(chǎn)物。電泳結(jié)果顯示，通過低嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增、兩步法擴(kuò)增或者高嚴(yán)謹(jǐn)擴(kuò)增，長(zhǎng)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大多能獲得清晰明亮的帶型但都不含目的序列；6個(gè)或8個(gè)堿基的引物其擴(kuò)增產(chǎn)物彌散或者根本檢測(cè)不到：10條10堿基引物中的8條可以產(chǎn)生比較清晰、帶型豐富的擴(kuò)增產(chǎn)物，而7條引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)鑒定呈陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物的總體陽性率達(dá)70％；從擴(kuò)增產(chǎn)物中一共回收了34條DNA片段，鑒定呈陽性的有17條，回收DNA的平均陽性率為50％。當(dāng)進(jìn)行兩輪單引物PCR擴(kuò)增

3、時(shí)，25種擴(kuò)增產(chǎn)物中有20種鑒定呈陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物的總體陽性率提高到80％。因此，本實(shí)驗(yàn)中的長(zhǎng)引物(19、22堿基)不適合單引物PCR；在較短的引物中，6、8堿基引物不適用于單引物PCR，而10堿基單引物PCR則是一種可行性較高的染色體步移策略。 啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式作用元件，為了了解葉綠體上的外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)器構(gòu)件蛋白基因Toc33的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以甘藍(lán)型油菜基因組DNA作為模板，從設(shè)計(jì)的一組10堿基引物中選取C3和C4進(jìn)

4、行兩輪單引物PCR擴(kuò)增，在C3的首輪和第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物中分別克隆到長(zhǎng)為1400 bp和613 bp的兩條目的片段。同源性比對(duì)的結(jié)果表明，大片段3’端491bp為Toc33基因的部分編碼區(qū)，而5’端909bp則為該基因的側(cè)翼序列；小片段3'端497bp為Toc33-like基因的部分編碼區(qū)，而5'端116bp則為該基因的側(cè)翼序列。Toc33基因的5'側(cè)翼區(qū)共含有5個(gè)TATA盒、6個(gè)CAAT盒、1個(gè)G盒、4個(gè)GATA盒、1個(gè)I盒、9個(gè)GT1C