甘藍(lán)型油菜花和種子特異表達(dá)基因的篩選及啟動(dòng)子鑒定.pdf

1、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）是我國最重要的油料作物，也是我國食用植物油的幾大來源之一。2009年起菜籽油就占我國油料作物產(chǎn)油的57％，但是國內(nèi)食用植物油自給率卻不到40%，而且南方冬閑田油菜含油量及產(chǎn)量較低、抗性較弱并且不適合機(jī)械化操作，所以分離出應(yīng)用價(jià)值較高的啟動(dòng)子來提高油菜光合效率和抗性等性狀，擴(kuò)大其種植面積與產(chǎn)量，對(duì)解決我國植物油問題具有重大意義。組織特異啟動(dòng)子是調(diào)控基因在特定的器官或組織部位表達(dá)的啟動(dòng)子，相較于組成

2、型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)造成浪費(fèi)及在特定部位表達(dá)量不足等缺點(diǎn)，具有極大優(yōu)勢(shì)，還能有效避免轉(zhuǎn)基因作物在種植中發(fā)生基因逃逸現(xiàn)象，對(duì)解決轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全問題具有重大意義。所以，從甘藍(lán)型油菜中分離并鑒定出油菜自身組織特異性啟動(dòng)子，研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，能為油菜和其近緣物種的基因功能研究及基因工程改良奠定基礎(chǔ)。本研究首先根據(jù)擬南芥基因芯片和白菜與甘藍(lán)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選在根、莖、葉、花和花蕾、角果皮、種子組織中特異表達(dá)候選基因，并利用實(shí)時(shí)熒光定量P

3、CR方法對(duì)候選基因進(jìn)行組織特異性檢測(cè)和表達(dá)模式分析；其次，利用5'RACE技術(shù)獲得其準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過同源克隆方法獲得SP3-1、SP6-1、ST-8-1、SC-2和FL-2啟動(dòng)子序列，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對(duì)其順式調(diào)控元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。最后，利用雙酶切技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的植物表達(dá)載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，然后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證并分析啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度和特異性。同時(shí)為了進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜花和種子的特異表達(dá)

4、基因，利用Illumina測(cè)序技術(shù)（基于RNA-seq），對(duì)甘藍(lán)型油菜品種中雙11的不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別將花和種子的轉(zhuǎn)錄組與其他組織器官轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行比較分析，以及特異表達(dá)基因分析，篩選具有花和種子特異表達(dá)的候選基因。最后，分別從篩選出的種子和花特異表達(dá)基因中各選取10個(gè)基因，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證并分析候選基因的特異性，為后續(xù)開發(fā)甘藍(lán)型油菜組織特異表達(dá)啟動(dòng)子奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　本

5、研究主要內(nèi)容包括：⑴采用生物信息學(xué)分析方法從擬南芥基因芯片及白菜與甘藍(lán)表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選鑒定了出10個(gè)組織特異表達(dá)的候選基因，從這10個(gè)候選基因中獲得了5個(gè)組織特異表達(dá)基因，qPCR分析結(jié)果表明SP3-1和SP6-1在莢果皮中特異表達(dá)、ST-8-1在莖中特異表達(dá)、SC-2在種皮中特異表達(dá)，F(xiàn)L-2在花器官中特異表達(dá)。通過對(duì)qPCR檢測(cè)片段、5'RACE末端及基因5'末端序列測(cè)序結(jié)果分析證實(shí)擴(kuò)增片段是來自qPCR檢測(cè)為組織特異表達(dá)的候選基因

6、，啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為1173-2400 bp（包含5'-UTR序列），轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于翻譯起始位點(diǎn)上游53-269 bp，并包含核心啟動(dòng)元件TATA-box及多個(gè)增強(qiáng)子元件CAAT-box，另外光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)元件也廣泛存在于啟動(dòng)子中。⑵克隆獲得的5個(gè)組織特異啟動(dòng)子片段，分別是SP3-1（2151 bp）、SP6-1（1173 bp）、ST-8-1（2100 bp）、SC-2（2400 bp）和FL-2（1939 bp），利用

7、SalI和NcoI雙酶切將SP3-1、SP6-1、ST-8-1及FL-2分別亞克隆到具有相同酶切位點(diǎn)粘性末端的載體骨架pCAMBIA1305.1中，最終成功構(gòu)建了promoter-GUS載體p1305.1-FL-2P，p1305.1-ST-8-1P，p1305.1-SP3-1P和p1305.1-SP6-1P；同樣利用BamHI和NcoI雙酶切將SC-2替換pCAMBIA1305.1上的CaMV35S啟動(dòng)子，得到植物表達(dá)載體p1305.1

8、-SC-2P，然后將構(gòu)建的植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中，從而獲得其工程菌株。⑶將上述構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體和p1305.1-FL-1P，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染擬南芥（col生態(tài)型）花序，成功獲得p1305.1-FL-1P轉(zhuǎn)基因陽性植株28株，p1305.1-SC-2P轉(zhuǎn)基因植株35株。將其培養(yǎng)至T3代，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了GUS蛋白活性及GUS基因表達(dá)模式分析，結(jié)果表明FL-1主要在花中表達(dá)，為花特異性啟動(dòng)子；SC-2在種

9、子中不表達(dá)，不具有種子特異性。⑷使用高通量RNA-seq技術(shù)，獲得了所有甘藍(lán)型油菜基因在種子萌發(fā)48 h的根、下胚軸、子葉、花期的根、莖、葉、花和花蕾及花后5d、9d、30d、46d的種子和角果皮的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）水平。不同組織器官及不同時(shí)期的種子和角果皮樣品經(jīng)過高通量測(cè)序后得到高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，得到了全基因組范圍的基因轉(zhuǎn)錄水平值FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per M

10、illion mapped reads）。篩選花和種子中最高表達(dá)量高于其他組織10倍以上的特異表達(dá)基因，得到花和花蕾特異基因1380個(gè)，種子特異基因2842個(gè)。利用Cytoscape中的BinGO對(duì)得到的特異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，以校正后的P-Value從細(xì)胞組件本體、分子功能本體和生物過程對(duì)篩選得到的特異候選基因進(jìn)行GO分類和富集分析，分別各取10個(gè)花和種子候選基因，用熒光定量PCR檢測(cè)其表達(dá)量，結(jié)果表明篩選的基因均為種子或花特異