OAS啟動子的克隆及其熒光素酶報告載體構(gòu)建和在表達(dá)HCV-core蛋白的L02細(xì)胞中的活性分析.pdf

1、目的：2'-5'寡腺苷酸合成酶(OAS)啟動子基因克隆及OAS啟動子-pGL3-Basic載體構(gòu)建，探討OAS啟動子在丙型肝炎特異性基因治療中的應(yīng)用。 方法： 1.以報道的OAS基因啟動子序列(-159到+82)為母板，設(shè)計兩端含有限制性內(nèi)切酶位點HindⅢ和SacⅠ的引物。以健康獻(xiàn)血員基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。 2.將分離純化的PCR產(chǎn)物用T4 DNA連接酶與pGL3-Basic載體相連，轉(zhuǎn)入J

2、M109感受態(tài)大腸桿茵，篩選陽性克隆，進(jìn)行HindⅢ和SacⅠ雙酶切鑒定并測序。 3.將pcDNA3.1(-)/core重組真核表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人胚胎肝細(xì)胞L02中，用RT-PCR和Western blot免疫印跡法檢測丙型肝炎病毒核心蛋白的表達(dá)。 4.將OAS Promoter-pGL3-Basic vector瞬時轉(zhuǎn)染入表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的L02細(xì)胞中，72h后檢測熒光素酶的活性。 結(jié)果：

3、 ①酶切及測序證實成功克隆2'-5'OAS啟動子基因，與GeneBank中2'-5'OAS啟動子序列一致。 ②經(jīng)測序、限制性酶酶切證實成功構(gòu)建了攜帶有2'-5'OAS啟動子的pGL3-Basic真核表達(dá)載體。 ③RT-PCR和Western blot免疫印跡法顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-core真核表達(dá)質(zhì)粒的L02細(xì)胞中有HCV-core蛋白的表達(dá)。 ④在表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的L02細(xì)胞中熒光素酶活性為未