雙啟動(dòng)子shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其在抑制腫瘤增殖研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的:RNA干擾技術(shù)是內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA誘發(fā)的mRNA水平上的基因沉默,具有高度特異性,已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。然而,以往研究報(bào)告中的shRNA表達(dá)載體都只能轉(zhuǎn)錄生成一種特異性的小干擾RNA,阻斷單一基因的表達(dá),很難對腫瘤這種多基因疾病起到治療效果。構(gòu)建出含有雙啟動(dòng)子的shRNA表達(dá)載體,并選擇在絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)的hTERT及Bcl-2基因進(jìn)行功能測試,考察這種雙啟動(dòng)子shRNA表達(dá)載體的基因沉默效果及對腫瘤細(xì)胞增

2、殖的影響。而且通過建立這種模式化工具載體,可以為今后RNA干擾技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究的開展和深入奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.改造實(shí)驗(yàn)室常用的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),切除CMV啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄終止序列,保留Ampr和Neor基因完整表達(dá)框以及原核復(fù)制起始點(diǎn),插入PCR擴(kuò)增人基因組DNA得到的兩段U6啟動(dòng)子,構(gòu)建出雙啟動(dòng)子shRNA表達(dá)載體pdPRO。
　　 2.針對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)與B細(xì)胞淋巴

3、瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因序列,根據(jù)短發(fā)卡RNA(shRNA)設(shè)計(jì)原則,化學(xué)合成編碼shRNA的DNA單鏈。將相應(yīng)的DNA單鏈退火后分別連在兩段U6啟動(dòng)子的下游,構(gòu)建出靶向hTERT和Bcl-2基因的shRNA重組質(zhì)粒pdPRO-TB。另外構(gòu)建對照質(zhì)粒pdPRO-T(靶向hTERT基因的shRNA重組質(zhì)粒)及pdPRO-B(靶向Bcl-2基因的shRNA重組質(zhì)粒),測序鑒定。<

4、br>　　 3.實(shí)驗(yàn)分為與實(shí)驗(yàn)平行不加細(xì)胞的空白對照組、空脂質(zhì)體組、陰性對照組(pdPRO組)、pdPRO-TB組、pdPRO-T組及pdPRO-B組。將各組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,每組6孔。MTT法檢測細(xì)胞增殖活性,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。
　　 結(jié)果:
　　 1.測序和酶切鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pdPRO、pdPRO-TB、pdPRO-T及pdPRO-B均成功構(gòu)建。
　　 2.各組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,與轉(zhuǎn)染前

5、正常生長的Hela細(xì)胞相比,pdPRO-TB組懸浮細(xì)胞明顯增多,貼壁細(xì)胞減少,細(xì)胞生長減慢;pdPRO-T與pdPRO-B組也出現(xiàn)類似改變,但不如pdPRO-TB組明顯；陰性對照組細(xì)胞形態(tài)無改變,培養(yǎng)板底部基本被細(xì)胞貼滿。
　　 3.MTT結(jié)果顯示,時(shí)間因素和組別因素對細(xì)胞增殖抑制率均有影響；時(shí)間與組別因素間存在交互作用。在24h、48h、72h,pdPRO-TB組、pdPRO-T組、pdPRO-B組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于空脂

6、質(zhì)體組和陰性對照組,pdPRO-TB組抑制細(xì)胞增殖的效果最強(qiáng),pdPRO-T組次之,pdPRO-B組抑制效果最弱；空脂質(zhì)體組與陰性對照組之間的細(xì)胞增殖抑制率相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后小干擾RNA對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用開始顯現(xiàn)、但效果尚弱,48小時(shí)最明顯,72小時(shí)抑制效果轉(zhuǎn)弱。
　　 結(jié)論:ShRNA重組質(zhì)粒pdPRO-TB可以抑制Hela細(xì)胞增殖,同時(shí)pdPRO-T及pdPRO-B對細(xì)胞增殖也有不同程度的抑制