一種新型慢病毒載體制備體系的初步建立.pdf

1、目的：以人類免疫缺陷病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體具有感染低分裂潛能細胞、整合目的基因至靶細胞基因組并可以長期穩(wěn)定表達、免疫反應(yīng)輕微等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用前景。 本系統(tǒng)采用“三質(zhì)粒+重組痘苗病毒”的方式生產(chǎn)慢病毒載體，期望獲得高拷貝數(shù)、安全型的適合臨床應(yīng)用的慢病毒載體。 方法：本系統(tǒng)主要生產(chǎn)方法為構(gòu)建主框架質(zhì)粒pVECRNA、包裝質(zhì)粒pGAGPOL及包膜質(zhì)粒pVSVG。通過脂質(zhì)體將這三個

2、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BHK21細胞，再用含有T7RNA聚合酶基因的重組痘苗病毒vTF-3感染細胞，在生產(chǎn)細胞中，痘苗病毒轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)指導(dǎo)T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯，然后T7RNA聚合酶指導(dǎo)慢病毒載體cDNA的轉(zhuǎn)錄，痘苗病毒RNA聚合酶指導(dǎo)包裝蛋白p24等以及包膜蛋白水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)的轉(zhuǎn)錄翻譯，最后由VSV-G包裝慢病毒載體RNA以及功能蛋白形成慢病毒顆粒，經(jīng)細胞分泌釋放到培養(yǎng)上清中，收集培養(yǎng)上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾得到慢

3、病毒載體。 結(jié)果：RT-PCR及測序比對結(jié)果提示培養(yǎng)上清中含有慢病毒載體的基因組RNA。當(dāng)三質(zhì)粒與輔助痘苗病毒共轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細胞BHK21，48h后，共聚焦顯微鏡下觀察到生產(chǎn)細胞表達p24蛋白，并且其主要分布于胞質(zhì)中，而在細胞核中基本不表達，這提示質(zhì)粒pGAGPOL構(gòu)建成功；普通倒置熒光顯微鏡下觀察到生產(chǎn)細胞表達GFP，提示質(zhì)粒pVECRNA構(gòu)建成功，以上結(jié)果也提示生產(chǎn)系統(tǒng)正常工作。將培養(yǎng)上清感染BHK21細胞和293T細胞，48h

4、后，倒置熒光顯微鏡下觀察到BHK21細胞和293T細胞均表達GFP，這提示利用本系統(tǒng)制備慢病毒載體顆粒的可行性。 為了提高系統(tǒng)產(chǎn)量，本研究對培養(yǎng)慢病毒載體所用的細胞系、質(zhì)粒用量、重組痘苗病毒和細胞數(shù)比例(MOI)三個對慢病毒載體生產(chǎn)起關(guān)鍵作用的條件進行優(yōu)化。每個因素取三個作用水平。所有結(jié)果在SPSS13.0軟件中整理，按照3*3*3析因方差分析方法分析實驗數(shù)據(jù)(計量資料用(x)±s表示，P＜0.05表示差異有顯著性意義)。

5、 實驗結(jié)果表明細胞系、質(zhì)粒用量以及MOI對載體產(chǎn)量有交互作用(F=7.728，P＜0.001)。 不同種生產(chǎn)細胞株之間慢病毒載體的產(chǎn)量有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(F=1789.772、P＜0.001)。以BHK21細胞的產(chǎn)量最高，載體拷貝數(shù)為(7036.78±3504.974)×108c/ml，大于Vero細胞產(chǎn)量(1670.89±968.55)×108c/ml及HepG2產(chǎn)量(416.41±186.99)×108c/ml。

6、不同的MOI對病毒載體產(chǎn)量有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(F=311.543、P＜0.001)。其中病毒載體拷貝數(shù)在MOI為1時病毒載體拷貝數(shù)最高。 不同的質(zhì)粒用量對病毒載體產(chǎn)量有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(F=137.268、P＜0.001)，病毒載體拷貝數(shù)在質(zhì)粒用量為10μg條件下最高。 通過不同細胞株產(chǎn)量之間的比較，發(fā)現(xiàn)以BHK21為生產(chǎn)細胞時的系統(tǒng)產(chǎn)量遠大于以HepG2和Vero細胞為生產(chǎn)細胞時的系統(tǒng)產(chǎn)量。因此以BHK21為生產(chǎn)細胞，對

7、質(zhì)粒用量和MOI進行3*3析因分析(計量資料用(x)±s表示，P＜0.05表示差異有顯著性意義)。 通過結(jié)果可以得知：不同的質(zhì)粒用量和MOI存在交互作用(F=9.980、P＜0.001)。 不同的質(zhì)粒用量對病毒載體產(chǎn)量有顯著性差異(F=92.997、P＜0.001)。其中病毒載體拷貝數(shù)在質(zhì)粒用量為10μg時病毒載體拷貝數(shù)最高。采用Tamhane法(方差不齊)進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒用量為5μg時的系統(tǒng)產(chǎn)量與質(zhì)粒用量為10μ

8、g(P=0.031)和15μg(P=0.021)時系統(tǒng)產(chǎn)量均有顯著性差異；質(zhì)粒用量為10μg時的系統(tǒng)產(chǎn)量與質(zhì)粒用量為15μg(P=0.987)時系統(tǒng)產(chǎn)量無顯著性差異。 不同的MOI對病毒載體產(chǎn)量有顯著性差異(F=174.778、P＜0.001)，病毒拷貝數(shù)MOI為1條件下產(chǎn)量最高。采用Tamhane法(方差不齊)進行兩兩比較，得到MOI為0.1和1時，系統(tǒng)產(chǎn)量沒有顯著性差異(P=0.801)，MOI為5時，系統(tǒng)產(chǎn)量與MOI為0.

9、1(P=0.01)和1(P=0.01)時的系統(tǒng)產(chǎn)量均有顯著性差異。 最后得出BHK21為生產(chǎn)細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)條件下，質(zhì)粒用量為pVECRNA10μg、pGAGPOL10μg、pVSVG2μg時，病毒載體拷貝數(shù)最高，達到(11707.67±802.263)×108c/ml。 在病毒載體拷貝數(shù)最優(yōu)條件下GFP方法測得載體滴度達到(1.3±0.18)×108tu/ml。 結(jié)論：我們利用新的生產(chǎn)體系成功制備出