用慢病毒載體介導(dǎo)癌基因建立細(xì)胞衰老的模型.pdf

1、癌基因的活化是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)生了持續(xù)活化型突變的RAS癌基因（H-rasV12）在與其他癌基因共同表達(dá)時(shí)能有效轉(zhuǎn)化嚙齒類動(dòng)物的細(xì)胞；然而其單獨(dú)表達(dá)卻在一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引發(fā)一種類似于細(xì)胞衰老的反應(yīng)。Serrano等于1997年的Cell雜志首次報(bào)道了這種癌基因活化誘導(dǎo)細(xì)胞衰老（oncogene-induced cellular senescence，OIS)的現(xiàn)象。其后，多種癌基因的活化以及抑癌基因的失活也相繼被發(fā)現(xiàn)能誘

2、導(dǎo)細(xì)胞的衰老反應(yīng)。
　　原癌基因發(fā)生異?；罨募?xì)胞是潛在的癌細(xì)胞，通過(guò)OIS機(jī)制可以將此類細(xì)胞引向衰老而不再增殖，因此OIS一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就被認(rèn)為是一種可能的抑癌機(jī)制。這一現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，2005年Michaloglou等報(bào)道，普遍存在于人類皮膚表面的“痣”是由衰老的黑素細(xì)胞構(gòu)成，且這些細(xì)胞均帶有BRAF癌基因的激活型突變，從而證明了OIS作為一種體內(nèi)普遍存在的保護(hù)性機(jī)制是阻止腫瘤發(fā)生的一道屏障。本文以慢病毒為載體介導(dǎo)持

3、續(xù)活化型的H-rasV12癌基因，重復(fù)了Serrano等于1997年建立的OIS的經(jīng)典模型。
　　本實(shí)驗(yàn)分為三部分：
　　1.建立過(guò)氧化氫和順鉑誘細(xì)胞衰老的模型。過(guò)氧化氫和順鉑，分別作為氧化應(yīng)激和DNA損傷應(yīng)激均有文獻(xiàn)報(bào)道能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。我們查閱文獻(xiàn)后通過(guò)反復(fù)摸索藥物濃度、處理時(shí)間，建立了誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的模型。細(xì)胞的衰老狀態(tài)的檢測(cè)選擇SA-β-gal染色和EdU摻入檢測(cè)DNA合成兩種指標(biāo)。我認(rèn)為和以往的文獻(xiàn)相比，我們的方法更為

4、簡(jiǎn)便和快速。
　　2.慢病毒載體的改構(gòu)。我們從美國(guó)Addgene網(wǎng)站以共享的方式定購(gòu)了慢病毒包裝系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)這套系統(tǒng)具有高效性的特點(diǎn)，但該慢病毒載體質(zhì)粒中并不含有任何真核細(xì)胞抗生素篩選標(biāo)記，這就為感染后用抗生素篩選穩(wěn)定整合的細(xì)胞造成了困難。為此我們對(duì)該慢病毒載體進(jìn)行了改造，通過(guò)將抗生素抗性基因克隆入該慢病毒載體，實(shí)現(xiàn)了病毒感染后的抗生素篩選，為下一步研究提供了方便。
　　3.用慢病毒載體介導(dǎo)癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。在改構(gòu)