慢病毒載體介導轉基因小鼠制備技術研究.pdf

1、研究目的及背景： 轉基因動物模型是聯(lián)系分子、細胞水平研究和整體動物研究的橋梁。自1980年Gordon首次采用原核顯微注射開展動物轉基因研究以來，已有十多種主要的轉基因動物制作方法，如原核顯微注射法、逆轉錄病毒侵染法、精子介導法、胚胎干細胞法，體細胞核移植法等。這些轉基因動物制備方法各有優(yōu)缺點：原核顯微注射法制作轉基因動物DNA整合效率低，整合位點不定，技術難度大，應用于高等哺乳動物時的效率很低；精子介導基因轉移技術技術存在隨機

2、性和不確定性；胚胎干細胞法制備的轉基因首建動物一般是嵌合體，不易實現(xiàn)外源基因的自然繁殖傳代，且建立干細胞系的難度較大，應用受到限制；體細胞核移植法操作難度大，且外源基因的表達與否受整合位點附近基因的影響。 相對而言，慢病毒侵染法在可操作性、胚胎發(fā)育率、移植妊娠率、目的基因整合效率、目的基因表達率、陽性個體的選育等方面比上述幾種技術均有顯著的優(yōu)勢。1976年，Jaenish首次用逆轉錄病毒(Retroviruses)感染胚胎制作轉

3、基因動物獲得成功。逆轉錄病毒的RNA進入細胞后，逆轉錄成DNA前病毒，利用逆轉錄病毒的整合酶及其特異的末端核苷酸序列，將DNA前病毒整合到染色體上，從而將其攜帶的外源基因也插入到染色體上。慢病毒(lentivirus)屬逆轉錄病毒的亞科，具有逆轉錄病毒的基本結構gag、pol和env，不同之處在于慢病毒包含4個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu和2個調節(jié)基因tat和rev。其中調節(jié)基因tat和rev分別編碼兩個反式激活因子Tat蛋

4、白和Rev蛋白，Tat蛋白在慢病毒基因組復制和轉錄延伸過程中發(fā)揮重要作用，Rev蛋白則可促使其基因的表達由早期向晚期轉化。HIV-1DNA前病毒的主要結構基因及其排列形式與其它逆轉錄病毒相同，為5’LTR-gag-pro-pol-env-3’LTR，其中gag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。慢病毒載體(Lentiviralvector，L

5、V)廣泛用于體外細胞的轉染和基因治療的研究。目前用LV成功轉染的細胞有神經(jīng)細胞、視網(wǎng)膜感光細胞、肌細胞，肝細胞、早期胚胎細胞等，用LV制作的轉基因動物有小鼠、大鼠、豬，牛等。LV的優(yōu)勢在于：1)轉染效率高，能夠感染分裂期和靜息期細胞，能轉染多種組織；2)整合到宿主基因組中的目的基因能持久穩(wěn)定的表達，不易形成嵌合體，一般能自然繁殖傳代：3)LV經(jīng)改構后，不在宿主細胞內增殖，也不會導致寄主細胞的死亡，免疫源性極小，生物安全性高。LV用于轉基

6、因動物模型制備也有一定的局限性：1)一是制備難度較大，不易獲得高滴度、高純度的病毒；2)LV在宿主基因組上的整合一般是隨機的，可能干擾插入位點及其附近基因表達；3)雖可通過控制病毒的滴度來調節(jié)轉入基因的拷貝數(shù)，但是不容易實現(xiàn)整合拷貝數(shù)的精確控制；4)攜帶目的基因的容量較小(＜10kb)，當需要插入大片段DNA時，會限制制備LV的滴度：5)LV前病毒DNA在宿主基因上是多位點隨機整合，當轉基因啟動子的表達需要多拷貝時應選擇原核顯微注射法。

7、 LV技術與siRNA結合使用，可以相對容易地在轉基因動物細胞中對特定基因實現(xiàn)RNAi效應。RNAi效應的核心是一段20-25nt的與靶基因mRNA互補或不完全互補的短RNA，通過它和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。要實現(xiàn)表達如此短的一段siRNA片段，轉基因載體的長度可以控制在很合適的范圍內(4～5kb)，對插入目的基因容量有限(＜10kb)的LV來說十分理想，因而LV在制備RNA干擾

8、轉基因動物模型上的優(yōu)勢更加明顯。 本實驗通過慢病毒介導高效地研制了eGFP轉基因小鼠，建立了慢病毒介導的轉基因小鼠制備技術體系，并利用該技術制備了樹突狀細胞(DentrenticCells，DCs)特異性干擾Rab32基因表達的RNA干擾小鼠模型，進一步驗證了利用該技術體系在小鼠樹突狀細胞實現(xiàn)對特定基因進行抑制的可行性與有效性。 研究內容及結果： 在第一部分，本課題開展了通過慢病毒載體介導、結合卵周隙顯微注射、以

9、eGFP為報告基因的轉基因小鼠制備方法學研究，探討了通過卵周隙顯微注射重組慢病毒對胚胎發(fā)育的影響，以及通過此法研制轉基因小鼠的效率。結果：1)建立并優(yōu)化了三質粒慢病毒包裝系統(tǒng)，獲得了滴度達到1×109TU/ml以上的注射用重組慢病毒；通過卵周隙顯微注射，胚胎的2-細胞卵裂率為81.8％(1189/1453)，與無處理組無顯著差異；在2-細胞期，每一視野下胚胎陽性率＞90％(1178/1189)，說明包裝的病毒成功并高效地轉染小鼠胚胎；2

10、)將注射后發(fā)育至2-細胞的胚胎通過輸卵管壺腹部穿刺移植法移植后，假孕母鼠妊娠率為42.8％(12/28)，很大程度上避免了傘部移植法出血導致的胚胎存活率下降，提高了移植成功率；3)eGFP首建鼠陽性率為60.8％(73/120)、轉基因小鼠的總體研制效率(轉基因小鼠數(shù)/注射胚胎數(shù))為5.0％(73/1453)，說明卵周隙顯微注射對胚胎2-細胞卵裂率幾乎無影響，表明慢病毒載體輔以卵周隙顯微注射法制作轉基因動物高效可行；4)將eGFP陽性首

11、建小鼠采用近交方法建系，至第6個世代，熒光觀察發(fā)現(xiàn)超排獲得的胚胎全部呈eGFP陽性，且新生鼠陽性率為100％，說明eGFP基因可以通過種系傳代。 在第二部分，采用了基于siRNA(SmallinterferingRNA)的RNA干擾策略、利用第一部分建立的轉基因平臺制作轉基因小鼠模型。轉基因RNA干擾載體FcdGW-Rab32的表達產(chǎn)物siRNA-Rab32可在小鼠樹突狀細胞(dendriticcells,DCs)中特異性干擾R

12、ab32基因，報告基因為eGFP。由于DCs中并沒有熒光素酶基因，構建了在DCs中特異性干擾熒光素酶基因的載體質粒FcdGW-FF3作為對照。結果：1)FcdGW-Rab32和FcdGW-FF3組的2-細胞卵裂率分別為79.8％(408/511)、75.8％(317/418)，受體妊娠率分別為35.7％(5/14)、33.3％(4/12)，移植胚胎體內存活率分別為2.7％(11/408)、2.8％(9/317)，轉基因首建鼠陽性率分別為

13、54.5％(6/11)、66.7％(6/9)，轉基因小鼠總體研制效率分別為1.2％(6/511)、1.4％(6/418)，除胚胎體內存活率和總體研制效率外，其他數(shù)據(jù)與第一部分的結果相當；2)經(jīng)PCR檢測和耳廓皮膚真皮層DCs熒光觀察結果表明，F(xiàn)cdGW-Rab32和FcdGW-FF3轉基因小鼠已被建立，目的基因已經(jīng)正確整合至轉基因小鼠基因組中，且能通過種系傳代；3)流式細胞儀檢測BMDC表明，eGFP只在小鼠的DCs內特異性表達，說明我

14、們所采用的CD11c啟動子具備較好的定向表達能力；4)通過相對熒光定量PCR(FluorenscentQuantitativePCR,FQ-PCR)對DCs的Rab32基因表達情況進行檢測，結果顯示Rab32基因的表達下調78.3％，特異性地實現(xiàn)了對DCs的Rab32基因產(chǎn)生Geneknock-down的干擾效應。 研究結論： 1.本課題成功建立了以慢病毒介導、結合卵周隙顯微注射、以eGFP為報告基因的轉基因小鼠制備技術