重組桿狀病毒作為一種新型的基因治療載體的研究.pdf

1、長期以來，由于其宿主特異性，桿狀病毒載體僅限于在昆蟲細胞內(nèi)表達外源蛋白。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒能有效轉導哺乳動物細胞并且可以在哺乳動物細胞中高效表達外源蛋白。由于其轉導效率高、易操作、增殖滴度高、易擴增、載體容載量大、在哺乳動物細胞中不復制和生物安全性好等優(yōu)點，重組桿狀病毒有望成為良好的基因治療載體。
　　 Apoptin是一種來源于雞貧血病毒的小蛋白，能特異性誘導大量的腫瘤細胞和轉化細胞產(chǎn)生凋亡，而

2、對正常二倍體細胞無凋亡誘導作用。特異的腫瘤細胞殺傷性使Apoptin成為癌癥基因治療的一種新的工具。
　　 Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne musculardystrophy，DMD）是一種以骨骼肌進行性變性、壞死為主要病理特征的致死性X-性連鎖隱性遺傳性肌病，目前尚無有效的治療方法，基因治療被認為是治療該病最有希望的途徑。但是現(xiàn)有的基因治療載體的載體容載量少、需要復制輔助病毒和存在著生物安全性等局限性大大的限

3、制它的臨床應用。因此提高治療基因在體內(nèi)的表達效率以及選擇合適的載體將是治療DMD獲得成功的關鍵。
　　 鑒于上述的研究背景，本研究探討了含有Apoptin蛋白的重組桿狀病毒在體外、體內(nèi)的抑瘤的作用；研究了含有microdystrophin蛋白的重組桿狀病毒在體內(nèi)和體外的microdystrophin表達情況，比較了重組桿狀病毒和重組腺病毒在體內(nèi)基因治療mdx鼠的效果。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1．重組桿狀病毒BV-Apo

4、ptin的構建
　　 從質粒pVAX-Apoptin中PCR擴增全長的Apoptin片段，經(jīng)酶切克隆到真核表達載體pcDNA3.1-HisB中，構建重組質粒pcDNA3.1-His-Apoptin。然后將CMV啟動子驅動的編碼Apoptin蛋白的整個讀碼框插入轉移載體pFast-VSV-G中VSV-G的下游，構建轉移載體pFast-G-Apoptin。將此重組質粒轉化DH10Bac大腸桿菌，通過藍白斑菌落及抗性篩選，獲得重組穿梭

5、載體Bacmid-Apoptin，提取其基因組并轉染sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒BV-Apoptin。
　　 2．重組桿狀病毒BV-Apoptin的體外轉導研究
　　 重組桿狀病毒BV-Apoptin在細胞中有正確的定位。在人肝癌細胞HepG2中Apoptin主要定位于細胞核，在人胚腎細胞HEK-293中，Apoptin定位于細胞質中。體外轉導試驗表明，構建的重組桿狀病毒BV-Apoptin能高效轉導HepG2細胞，

6、Apoptin的表達水平與桿狀病毒的感染劑量成正相關，當感染復數(shù)越高，表達Apoptin蛋白的細胞數(shù)越多。
　　 3．重組桿狀病毒BV-Apoptin在體外、體內(nèi)的抑瘤作用
　　 將重組桿狀病毒BV-Apoptin分別以不同感染復數(shù)轉導HepG2細胞，通過DNA-Ladder和TUNEL檢測細胞凋亡。結果顯示，重組桿狀病毒BV-Apoptin能夠誘導轉導的人肝癌細胞HepG2的產(chǎn)生凋亡，并且BV-Apoptin誘導腫瘤細

7、胞凋亡的能力呈劑量依賴性。實驗利用異體同源腫瘤細胞系移植的方法復制了C57BL/6小鼠荷H22腫瘤模型，研究構建的重組桿狀病毒BV-Apoptin的體內(nèi)抑瘤效果。結果顯示，注射BV-Apoptin能夠明顯抑制小鼠腫瘤的生長，同時也提高荷瘤小鼠的存活率。以上結果提示，重組桿狀病毒BV-Apoptin有望成為治療腫瘤的一種新的有效手段。
　　 4．重組桿狀病毒BV-MICDYS的構建
　　 從載體pcDNA3.1（+）中酶切

8、CMV啟動子的表達框，插入轉移載體pFast-VSV-G中VSV-G的下游，構建轉移載體pFast-G-CMV；然后從質粒pBSK-MICRO酶切全長的microdystrophin基因，分別克隆到pFast-G-CMV中，構建質粒pFast-G-MICDYS。轉化DH10Bac大腸桿菌，通過藍白斑菌落及抗性篩選，獲得重組穿梭載體Bacmid-MICDYS，提取其基因組并轉染sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒BV-MICDYS。
　

9、　 5．重組桿狀病毒BV-MICDYS轉導C2C12細胞
　　 將構建的重組桿狀病毒BV-MICDYS以不同的感染復數(shù)（50、100、200MOI）轉導C2C12細胞，轉導后48h檢測microdystrophin基因的表達。結果顯示，重組桿狀病毒BV-MICDYS能高效轉導C2C12細胞，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。結果還顯示，相同感染復數(shù)的Ad-MICDYS感染的C2C12細胞中microdystrophin蛋白表達數(shù)量低于相同

10、感染復數(shù)BV-MICDYS轉導的C2C12細胞中microdystrophin蛋白表達數(shù)量，說明了在C2C12細胞中，桿狀病毒有著比腺病毒更高的靶基因表達水平的能力。
　　 6．體內(nèi)研究重組桿狀病毒BV-MICDYS在mdx TA中的轉導
　　 將重組桿狀病毒BV-MICDYS分別以不同的劑量（1010pfu/mL，109pfu/mL，108pfu/mL）注射到mdx TA，2周和8周后做肌肉組織冰凍切片，HE檢測肌肉病