重組TORC1慢病毒載體修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分:大鼠 TORC1基因的擴(kuò)增及重組慢病毒載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建攜帶大鼠TORC1(transducer of regulated CREB activity 1）目的基因的重組慢病毒，并初步檢測其體外表達(dá)目的基因的能力。
　　 方法：PCR法擴(kuò)增出TORC1 編碼區(qū)片段，定向克隆入pGC-FU 載體，Lipofectamine 2000法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝攜帶TORC1

2、目的基因的重組慢病毒，測序證實(shí)為TORC1 重組慢病毒后大量擴(kuò)增，以實(shí)時(shí)定量PCR法測定病毒滴度，western blot法檢測TORC1 在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了攜帶大鼠TORC1 目的基因的重組慢病毒，并證實(shí)其在293T細(xì)胞中可高水平表達(dá)TORC1。
　　 結(jié)論：大鼠TORC1 重組慢病毒可在體外高表達(dá)其所攜帶目的基因，為研究TORC1 在脊髓損傷中的作用打下基礎(chǔ)。
　　 第二部分：T

3、ORC1重組慢病毒的體外生物學(xué)效應(yīng)
　　 目的：研究TORC1 重組慢病毒載體對大鼠原代脊髓運(yùn)動神經(jīng)元（SMN）的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 方法：取1-3 d 新生大鼠進(jìn)行原代SMN 培養(yǎng)，用構(gòu)建好的TORC1 重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染SMN，應(yīng)用RT-PCR、Western Blot 及細(xì)胞形態(tài)學(xué)驗(yàn)證其對SMN TORC1mRNA、蛋白表達(dá)的影響，以及對SMN 生長情況的作用。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)出大鼠原代SMN，用構(gòu)建

4、的TORC1 重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代SMN，可以明顯提高TORC1mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并改善了神經(jīng)元軸突生長情況。以正常組和空白載體組細(xì)胞作對照，實(shí)驗(yàn)組TORC1 mRNA和蛋白表達(dá)量均有明顯提高(P<0.05)，而且效果持久，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)軸突長度明顯優(yōu)于其他2組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：TORC1 重組慢病毒載體可以有效地提高SMN TORC1基因表達(dá)并促進(jìn)其生長，為后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部

5、分：TORC1重組慢病毒的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)
　　 目的:建立大鼠脊髓損傷模型，研究TORC1 重組慢病毒載體在脊髓損傷修復(fù)中的作用。
　　 方法: 取健康成年SD大鼠，切斷T10 脊髓，建立脊髓損傷動物模型，術(shù)中將TORC1重組慢病毒載體和pGC-FU 載體注入損傷區(qū)，術(shù)后2 周、4 周、6 周進(jìn)行BBB 評分，并通過RT-PCR、Western blot檢測TORC1 mRNA 及蛋白表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色觀察神經(jīng)纖