Necrostatin-1對大鼠脊髓損傷保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、目的:研究探討Necroptosis（程序性壞死）抑制劑Necrostatin-1對大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.選擇90只雌性SD實驗大鼠，隨機(jī)分為四組，即Sham組（假手術(shù)組，n=21）;SCI組(脊髓損傷組，T10脊髓頓挫傷組，n=24);NS組（生理鹽水組，T10脊髓頓挫傷+0.9％Nacl，20ul，鞘內(nèi)，n=21）;Nec-1組(Nec-1治療組，T10脊髓頓挫傷+20ug/ulNec-1，20u

2、l，鞘內(nèi)，n=24)。造模選用改良Allen's法。
　　2.觀察項目:
　　(1)行為學(xué)情況:參照BBB評分于脊髓損傷后不同時間點，評價各組實驗大鼠的后肢運動功能恢復(fù)情況。
　　(2)誘發(fā)電位的測定:損傷后1d、3d、7d各組進(jìn)行皮質(zhì)運動誘發(fā)電位MEP的測定。
　　(3) HE染色:損傷后7d各組大鼠灌注取材，脊髓冠狀冰凍切片HE染色觀察，檢測壞死區(qū)面積。
　　(4)立春紅2R-亮綠染色:模型組與治療組在

3、損傷后7d進(jìn)行灌注固定取材，行脊髓橫斷位冰凍切片立春紅2R-亮綠染色，觀察和測量神經(jīng)元存活情況及髓鞘染色相對積分光密度值。
　　(5) PI熒光染色:各組于脊髓損傷后24h進(jìn)行灌注固定取材，行脊髓橫斷位冰凍切片熒光鏡下觀察，檢測細(xì)胞壞死的情況。
　　(6) RIP3的表達(dá)情況:各組于脊髓損傷后24h進(jìn)行NS灌注取材，Western blot檢測RIP3表達(dá)情況。
　　(7)前炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)

4、的表達(dá)情況:各組于脊髓損傷后24h進(jìn)行NS灌注取材，ELISA法檢測各因子的表達(dá)情況。
　　(8) MDA的含量情況:各組于損傷后24h快速活體取材，采用TBA比色法檢測ROS氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物MDA的含量情況。
　　結(jié)果:
　　(1)本實驗Nec-1鞘內(nèi)給藥及建立的大鼠脊髓鈍挫傷模型穩(wěn)定可靠，可重復(fù)性好。
　　(2)大鼠損傷后1d BBB評分為0，以后逐漸恢復(fù)，Nec-1治療組在傷后7天大鼠后肢運動功能恢復(fù)明顯（

5、后肢全部三個關(guān)節(jié)可活動，可見廣泛活動關(guān)節(jié)），BBB評分高于其它損傷組(P＜0.001);在傷后14天、21天、28天Nec-1治療組后肢運動功能恢復(fù)均好于SCI組和NS組，且BBB評分有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。SCI組與NS組沒有差異(P＞0.05)。
　　(3)脊髓損傷后1d、3d測量MEP，損傷各組均無明顯主反應(yīng)成近水平的規(guī)則波浪線。脊髓損傷后7d，損傷各組均能檢測到主反應(yīng)，其中SCI組和NS組的波形低鈍，潛伏期延長，峰峰

6、值明顯減小，Nec-1治療組較上述兩組潛伏期縮短，峰峰值升高，差異有顯著性。SCI組與NS組無差異。
　　(4) Nec-1治療組在脊髓損傷后7d與SCI組和NS組相比較壞死區(qū)面積減小(P＜0.01)，病理變化減輕，存活神經(jīng)元增多，尤其在損傷區(qū)周圍更為明顯。(5) Nec-1治療組在脊髓損傷后7d與損傷組相比較髓鞘著色相對IOD值增加，灰質(zhì)內(nèi)存活神經(jīng)元增多，差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.001);且結(jié)構(gòu)排列較完整，囊腔樣變性

7、減輕。
　　(6)與Sham組相比較，脊髓損傷后RIP3表達(dá)明顯升高，PI陽性細(xì)胞亦顯著增加(P＜0.001)。給予Nec-1后RIP3表達(dá)及PI陽性細(xì)胞數(shù)均減少，差異有顯著性(P＜0.001)。且脊髓中RIP3表達(dá)與PI陽性細(xì)胞數(shù)顯著正相關(guān)(r=0.915，P＜0.001)。SCI組與NS組無差異。
　　(7)假手術(shù)組各前炎癥因子含量水平較低，脊髓損傷后各因子含量均升高(P＜0.001)，給予Nec-1干預(yù)后各因子含量均降

8、低(P＜0.001)，但是仍高于假手術(shù)組(P＜0.001)。SCI組與NS組無差異。
　　(8)假手術(shù)組MDA含量水平較低，脊髓損傷后MDA含量均明顯升高(P＜0.001)，給予Nec-1干預(yù)后MDA含量水平明顯降低(P＜0.01)，但仍比假手術(shù)組高(P＜0.01)。SCI組與NS組無差異。
　　結(jié)論:
　　Nec-1對脊髓損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，并能改善大鼠后肢運動功能及皮質(zhì)運動誘發(fā)電位的恢復(fù)情況。
　　Nec-1