Survivin和FoxM1B靶向的shRNA對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞干細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建Survivin(存活素)，F(xiàn)oxM1B的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNAshRNA)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1.依據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)siRNA，shRNA模板的末端是5-6多聚寡核苷酸，終止信號(hào)是由RNA pol Ⅲ來(lái)完成，LOOP環(huán)序列是5'-UUCAAGAGA--3，5'-GGAA-3'是RNA pol Ⅲ下游的終末位點(diǎn)，兩條寡核苷酸末端

2、5'端的限制位點(diǎn)是BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，BamH Ⅰ位點(diǎn)的下游有一個(gè)G或A殘基，因?yàn)镽NApol Ⅲ偏向用嘌呤轉(zhuǎn)錄，克隆入pSilencer<'TM>3.1-H1 neo質(zhì)粒H1啟動(dòng)子的下游，建立shRNA表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，酶切，測(cè)序鑒定正確后擴(kuò)增質(zhì)粒。 2.腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)傳代。 3.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照，Survivin干擾組，F(xiàn)oxM1B干擾組，雙干擾組，陰性質(zhì)粒對(duì)照組，脂質(zhì)體2000(Lip<'TM>20

3、00)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為轉(zhuǎn)染1，3，5，7天。逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，Western Blotting在mRNA和蛋白水平檢測(cè)目的基因的表達(dá)，MTT法檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。用Hoechst染色試劑盒檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建Survivin，F(xiàn)oxM1B shRNA表達(dá)質(zhì)粒，酶切，測(cè)序分析克隆成功，序列完全正確。 2.轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，相比空白對(duì)

4、照組與陰性質(zhì)粒對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA和蛋白表達(dá)在第3天后表達(dá)明顯降低(P<0.05)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)顯示Survivin抑制率第3，5，7天分別為80.27±11.65，77.41±10.99，78.10±8.84。FoxM1B第3，5，7天抑制率分別為72.45±9.59，70.50±9.43，67.94±13.57，Western Blotting顯示Survivin第3，5，7天抑制率分別為76.55

5、±18.01，73.57±15.41，72.05±11.46，F(xiàn)oxM1B第3，5，7天抑制率分別70.20±9.95，68.32±12.53，65.76±12.10而對(duì)照基因組DNA GAPDH的表達(dá)無(wú)影響。 3.干擾組與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率增加，雙干擾較單干擾明顯(P<0.05)。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建Survivin，F(xiàn)oxMlB shRNA表達(dá)質(zhì)粒。 2.轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤干膠質(zhì)瘤細(xì)胞后能夠