應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP）體外誘導(dǎo)胰島新生.pdf

1、第一部分大鼠胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 目的:建立成年大鼠胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定的方法。 方法: V型膠原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺組織，并經(jīng)過Ficoll密度梯度離心去除胰島組織，然后培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，而后加入EGF(表皮生長(zhǎng)因子)和bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)繼續(xù)培養(yǎng)，7天可形成單層細(xì)胞，用0.25％胰酶-EDTA消化并傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞利用免疫熒光染色

2、和RT-PCR方法檢測(cè)CKl9、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表達(dá)。 結(jié)果:經(jīng)膠原酶灌注消化胰腺導(dǎo)管上皮，再經(jīng)過Ficoll密度梯度離心去除胰島組織，可使胰腺導(dǎo)管細(xì)胞得到較好的純化。免疫熒光結(jié)果示胰腺導(dǎo)管細(xì)胞CKl9、Pdx-1和Nestin染色呈陽性，陽性細(xì)胞率分別為(88.6±6.2)％，(84.6±8.6)％，(79.3±10.5)％，而insulin及glucagon染色為陰性。RT-PCR

3、結(jié)果顯示該細(xì)胞表達(dá)CK19、Pdx-1和Nestin基因。 結(jié)論:該方法可較好的分離出胰腺導(dǎo)管細(xì)胞，經(jīng)鑒定該法培養(yǎng)所獲細(xì)胞具有胰腺干細(xì)胞的特性。 第二部分應(yīng)用INGAP體外誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞向胰島D細(xì)胞分化 目的:建立體外誘導(dǎo)胰腺干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)建立新的誘導(dǎo)分化體系，實(shí)現(xiàn)體外胰島新生。 方法:體外分離培養(yǎng)SD大鼠胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞，選取第2～6代干細(xì)胞進(jìn)行分

4、步誘導(dǎo)分化，并于分化后期進(jìn)行分組培養(yǎng)，INGAP組加入INGAP多肽，而對(duì)照多肽組加入對(duì)照多肽，誘導(dǎo)結(jié)束后收獲兩組新生類胰島樣細(xì)胞團(tuán)(ILCs)分別行免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)insulin和glugagon的表達(dá)，并通過葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn)(GSIS)評(píng)價(jià)新生ILCs的胰島素分泌能力。 結(jié)果:第2～6代胰腺導(dǎo)管干細(xì)胞經(jīng)過體外四步誘導(dǎo)分化，INGAP組和對(duì)照多肽組均可形成ILCs，免疫熒光染色結(jié)果顯示ILCs insu

5、lin和glucagon染色均為陽性，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也證明INGAP組和對(duì)照多肽組ILCs均有insulin和glucagon基因的表達(dá)，其中insulin基因的相對(duì)表達(dá)量INGAP組為0.324±0.09，對(duì)照多肽組為0.102±0.04，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；glucagon基因的相對(duì)表達(dá)量INGAP組為0.260±0.05，對(duì)照多肽組為0.085±0.04，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而IN

6、GAP組insulin和glucagon相對(duì)表達(dá)量與正常胰島比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新生ILCs在低糖和高糖刺激下的刺激指數(shù)INGAP組為(3.3±0.1)，對(duì)照多肽組為(2.6±0.4)，正常胰島為(3.1±0.4)；低糖和高糖刺激下胰島素分泌量INGAP組與對(duì)照多肽組相比有明顯增多(P<0.01)。 結(jié)論:通過建立的新的包含INGAP多肽的誘導(dǎo)分化體系可以獲得具有胰島素分泌功能的新生類胰島樣細(xì)胞團(tuán)，為胰島移植來源提供了新的更有