MSCs在受體體內(nèi)的分布及對(duì)不相合小鼠allo-HSCT后GVHD及GVT影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景和目的 異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是目前治療各種造血系統(tǒng)及非造血系統(tǒng)腫瘤、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病及某些遺傳性疾病的主要和有效手段。allo-HSCT的效果、預(yù)后、移植后患者的無(wú)病生存率、長(zhǎng)期生存率及生活質(zhì)量取決于患者移植后免疫系統(tǒng)的重建情況、移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生和程度、移植物抗腫瘤（GVT）效應(yīng)及繼發(fā)感染等。其中，GVHD發(fā)生情況和患者移植后免疫系統(tǒng)重建情況，包括免疫缺陷的程度、持

2、續(xù)時(shí)間及是否發(fā)生繼發(fā)性感染等，是影響allo-HSCT效果及預(yù)后的關(guān)鍵。移植后GVHD及免疫重建延遲或GVT效應(yīng)削弱等導(dǎo)致的感染、腫瘤復(fù)發(fā)以及第二腫瘤發(fā)生是allo-HSCT后的主要并發(fā)癥和致死原因，嚴(yán)重影響患者移植后長(zhǎng)期生存率和生活質(zhì)量。因此，降低移植后GVHD發(fā)生率、減輕GVHD嚴(yán)重程度、提高GVT效應(yīng)、減少免疫缺陷持續(xù)時(shí)間、減輕免疫缺陷程度及加速免疫系統(tǒng)重建是提高患者移植后長(zhǎng)期生存率和生存質(zhì)量的重要方法和手段。 間充質(zhì)干細(xì)

3、胞（MSCs）是一種具有多分化潛能的非造血干細(xì)胞，廣泛分布于骨髓、臍血、脂肪等組織中。MSCs表面低表達(dá)MHC-Ⅰ，不表達(dá)MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD40L、B7-1、B7-2，同時(shí)能逃避同種異基因T淋巴細(xì)胞的識(shí)別，提示MSCs具有弱免疫原性，能抑制T、B、NK、DC細(xì)胞的功能，通過(guò)各種途徑釋放細(xì)胞因子或通過(guò)細(xì)胞間直接或（和）間接作用，誘導(dǎo)免疫耐受。MSCs因具有多器官歸巢、優(yōu)先定位于受損傷靶器官、參與細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，

4、已被廣泛應(yīng)用于allo-HSCT后GVHD的預(yù)防與治療、器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)防以及組織工程及各種自身免疫性疾病的治療等方面。照射、化療、免疫抑制劑等因素被認(rèn)為能夠促進(jìn)MSCs的歸巢以及向組織特異性細(xì)胞的分化，但具體機(jī)制尚不清楚。目前有關(guān)受體免疫功能是否影響MSCs在體內(nèi)植入的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以同基因小鼠及裸鼠模型為基礎(chǔ)，經(jīng)尾靜脈輸注MSCs，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法定期追蹤體內(nèi)Y染色體標(biāo)記MSCs，分別觀察供體細(xì)胞在各受鼠體內(nèi)的分布與定居

5、情況，有助于我們了解MSCs是否在正常與免疫缺陷受體中的分布、定居及遷移方面存在差異，為MSCs移植安全性的評(píng)價(jià)提供前期實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)。 現(xiàn)時(shí)預(yù)防及治療GVHD的措施主要是大量應(yīng)用細(xì)胞毒藥物及免疫抑制劑，雖然可有效降低GVHD的發(fā)生，但同時(shí)也削弱GVT效應(yīng)，加重移植后患者的免疫缺陷程度，使移植后感染及腫瘤復(fù)發(fā)率明顯提高。如何建立特異性免疫耐受減輕GVHD同時(shí)保留GVT效應(yīng)，是改善allo-HSCT效果亟待解決的問(wèn)題，也是移植免疫

6、學(xué)所面臨的難題。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明MSCs在造血支持及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，提示MSCs可能在減輕GVHD反應(yīng)同時(shí)增強(qiáng)GVT效應(yīng)中扮演重要的角色，是應(yīng)用前景最為廣闊的種子細(xì)胞。本研究另外構(gòu)建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤動(dòng)物模型，將第三方KM小鼠骨髓MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)后與近交系C57BL/6小鼠的脾臟及骨髓細(xì)胞共移植，探討第三方來(lái)源MSCs在促進(jìn)MHC不相合allo-HSCT后免疫重建、誘導(dǎo)免疫耐受的同時(shí)對(duì)GVT效

7、應(yīng)的影響。 二、研究方法 1.構(gòu)建同基因小鼠及裸鼠模型 2.實(shí)驗(yàn)分組：分別于輸注MSCs后24h、72h、1w、2w及1w、2w、4w、6w分批處死雌性BALB/c同基因小鼠及裸鼠（5只/批），并依次留取肺臟、肝臟、脾臟、結(jié)腸、胸腺及骨髓組織。 3.實(shí)時(shí)定量PCR（SYBR Green法）檢測(cè)各組受鼠器官組織SRY基因相對(duì)表達(dá)水平 4.構(gòu)建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤動(dòng)物模型 5

8、.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分7組，分別為低劑量第三方MSCs移植組（A組），中劑量第三方MSCs移植組（B組），高劑量第三方MSCs移植組（C組），高劑量供鼠MSCs移植對(duì)照組（D組），單純allo-HSCT組（E組），B16+TBI對(duì)照組（F組），B16成瘤對(duì)照組（G組）。 6、造血重建標(biāo)準(zhǔn)：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）>1．0×109/L為造血重建指標(biāo)，并通過(guò)嵌合體檢測(cè)證實(shí)骨髓植入成功。 7.嵌合體檢測(cè)：PCR擴(kuò)增外周血基因組Y

9、染色體基因 8.aGVHD表現(xiàn)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：aGVHD判斷通過(guò)觀察：體重變化、食欲、精神狀態(tài)，活動(dòng)能力，皮膚黏膜，腹瀉等情況，并計(jì)算平均生存時(shí)間；另取瀕死受鼠皮膚、肝臟、小腸等組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。 9.流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群：于骨髓移植后+7d開(kāi)始，每周每組取3～4只受鼠行FACS檢測(cè)外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例變化。 10.外周血上清細(xì)胞因子lFN-γ、

10、IL-2、IL-4及TGF-β檢測(cè)：移植后+14d采用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。 11.移植動(dòng)物成瘤情況觀察：腫瘤導(dǎo)致死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物死亡時(shí)WBC）1．5×109/L，腫瘤明顯增大，甚至破潰壞死，無(wú)明顯aGVHD臨床表現(xiàn)。待出現(xiàn)可觸及的腫塊時(shí)記為腫瘤出現(xiàn)時(shí)間，用游標(biāo)千分尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)直徑（L）和與其垂直的最大橫徑（W），以后每3d測(cè)量1次，直至腫瘤出現(xiàn)破潰或小鼠死亡。 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)

11、軟件包進(jìn)行處理。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用析因方差分析分別對(duì)不同時(shí)間段的同基因小鼠及裸鼠的肺臟、肝臟、脾臟、結(jié)腸、胸腺、外周血及骨髓等臟器組織的SRY基因表達(dá)變化差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，移植后外周血淋巴細(xì)胞亞群變化采用重復(fù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用LSD或Dunnett's T3多重比較法。一個(gè)因變量與多個(gè)自變量間的線(xiàn)性數(shù)量關(guān)系用linear regression進(jìn)行逐步回歸

12、統(tǒng)計(jì)分析。P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并對(duì)小鼠生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier生存模型分析，繪制生存時(shí)間曲線(xiàn)。缺失數(shù)據(jù)：預(yù)處理后存活時(shí)間少于5d視為移植失敗，不作統(tǒng)計(jì)。 三、結(jié)論 1.MSCs輸注安全，未發(fā)現(xiàn)有毒副作用。 2.MSCs在正常與免疫缺陷或致死量照射的同種異體中的分布、定居及遷移方面存在差異，其植入細(xì)胞量及時(shí)間與受體免疫功能密切相關(guān)。 3.第三方或供者來(lái)源MSCs均可促進(jìn)MHC不相合a