烏司他丁對(duì)膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)理探討.pdf

1、背景
　　 膿毒癥自20世紀(jì)70年代以來(lái)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大問(wèn)題之一。隨著社會(huì)人口老齡化、免疫抑制藥物的使用以及耐藥菌的出現(xiàn)，膿毒癥的發(fā)病率以每年1.5％的速度增長(zhǎng)，成為危重病人主要的死亡因?yàn)橹?。心肌損傷是膿毒癥常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是影響膿毒癥轉(zhuǎn)歸的重要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膿毒癥合并心功能障礙使膿毒癥死亡率由不合并心功能障礙的20％增長(zhǎng)到70％-90％。因此，針對(duì)膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機(jī)制開(kāi)展深入研究及早期防治，對(duì)提高膿毒癥的救治水平具有

2、重要意義。
　　 膿毒癥的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，導(dǎo)致心肌損傷的途徑多樣化。普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為并非細(xì)菌本身，而是過(guò)度的全身炎癥反應(yīng)造成炎癥因子大量釋放導(dǎo)致了膿毒癥心肌損傷。其中，腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)是主要由單核一巨噬細(xì)胞受細(xì)菌毒素等刺激后產(chǎn)生的重要炎癥因子，也是膿毒癥時(shí)炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大的重要介質(zhì)。后者可進(jìn)一步刺激中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞，導(dǎo)致進(jìn)一步釋放大量促炎因子。在動(dòng)物模型、離體心臟及

3、心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)，TNF-α可以通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)而損傷心肌收縮力。其次，除免疫細(xì)胞外，內(nèi)皮細(xì)胞激活也是膿毒癥的重要特征。膿毒癥時(shí)，組織因子κB(Nuclear factor kappaB，NF-κB)和激活物蛋白1(Activator protein 1，AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子激活，進(jìn)一步激活內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎癥因子(包括IL-1β、ICAM-1、E-selectin及VCAM-1等)。其中，內(nèi)皮素-1(ET

4、-1)是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的維持血管緊張度的強(qiáng)烈的縮血管肽，其主要生理功能是與舒血管物質(zhì)共同維持血管緊張度。近年研究認(rèn)為，ET-1可能還具有促凋亡及促炎癥反應(yīng)的作用，與膿毒癥休克的發(fā)生及死亡率密切相關(guān)。因此，本研究重點(diǎn)觀察了TNF-α及ET-1兩種細(xì)胞因子的變化，進(jìn)一步明確二者在膿毒癥心肌損傷中的地位。
　　 然而，炎癥因子的產(chǎn)生受復(fù)雜的瀑布式的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)控制，各種細(xì)胞因子的促炎作用也具有相互交織的效應(yīng)。因此，從關(guān)鍵的靶點(diǎn)控制炎癥反應(yīng)的

5、擴(kuò)大才是阻止膿毒癥心肌損傷的重點(diǎn)。p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，p38MAPK/NF-κB通路是炎癥因子產(chǎn)生的重要通路之一，被認(rèn)為是炎癥通路中的重要的瓶頸環(huán)節(jié)之一，在膿毒癥心肌損傷中具有重要意義。已有研究表明p38MAPK抑制劑可減少離體膿毒癥心肌NF-κB激活及TNF-α表達(dá)，減輕膿毒癥心肌收縮力受損程度。但在完整動(dòng)物模型上，p38MAPK通路對(duì)膿毒癥心肌炎癥因子尤其是TNF-α及ET-1的影響仍需進(jìn)一步明確。
　　

6、 烏司他丁(Ulinastatin，UTI)是從健康男性尿液中提取的尿胰蛋白酶抑制劑，近年來(lái)已經(jīng)應(yīng)用于胰腺炎、創(chuàng)傷、體外循環(huán)及膿毒癥等全身炎癥反應(yīng)綜合癥，并證實(shí)具有一定抗炎作用，但其作用機(jī)制及在體內(nèi)的有效劑量并未明確。文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了UTI對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷、急性腎損傷具有保護(hù)作用，但關(guān)于UTI對(duì)膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用的研究尚不多。
　　 目的
　　 探討UTI對(duì)膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用及可能的保護(hù)機(jī)制，為臨床早期

7、應(yīng)用UTI治療膿毒癥心肌損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組(C組)、假手術(shù)組(S組)、膿毒癥組(M組)，小劑量干預(yù)組(UTI5000U/Kg，A組)和大劑量干預(yù)組(UTI20000U/Kg，B組)，每組8只。采取盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(Cecal ligation andpuncture，CLP)建立膿毒癥模型，24h后動(dòng)脈采血及分離左心室心肌。觀察心肌顯微及超微結(jié)構(gòu)改變，采用酶聯(lián)免疫吸

8、附雙抗體夾心(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)方法檢測(cè)大鼠血清心肌肌鈣蛋白I(Cardiac troponinI，cTnI)、心肌腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)，放射免疫方法(Radioimmunoassay)檢測(cè)心肌內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)，免疫印跡(Westernblot)方法檢測(cè)心肌p-p38、p38絲裂原活化蛋白激

9、酶(Mitogen-activated proteinkinase，MAPK)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果
　　 1.膿毒癥大鼠心肌損傷模型的評(píng)價(jià)
　　 CLP方法是復(fù)制膿毒癥模型的經(jīng)典方法之一。CLP24h后M組心肌與C組、S組比較，光鏡下心肌結(jié)構(gòu)排列疏松，細(xì)胞核腫脹，間質(zhì)水腫、充血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；電鏡結(jié)構(gòu)示心肌肌絲、肌節(jié)結(jié)構(gòu)排列紊亂，間質(zhì)水腫，線(xiàn)粒體嵴斷裂，明顯空泡化；同時(shí)伴有血清cTnI水平顯著升高，說(shuō)明CLP2

10、4h后已經(jīng)存在心肌損傷，該膿毒癥模型可以用于膿毒癥心肌損傷的研究。
　　 2.UTI對(duì)膿毒癥心肌病理結(jié)構(gòu)及血清cTnI的影響
　　 光鏡下，A組心肌充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度與M組比較無(wú)明顯減輕；電鏡結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)疏松，肌節(jié)斷裂，線(xiàn)粒體廣泛空泡化，與M組比較均無(wú)明顯減輕。而B(niǎo)組心肌光鏡下肌纖維結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，間質(zhì)水腫、充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度與M組及A組比較明顯減輕；電鏡下心肌輕度腫脹，線(xiàn)粒體無(wú)明顯腫脹，部份線(xiàn)粒體空泡

11、化，與M組及A組比較心肌病變程度減輕。
　　 C組、S組cTnI分別為(1.05±0.21)ng/ml和(1.26±0.24)ng/ml，兩組間無(wú)顯著性差異(P=0.512)，M組為(7.58±0.53)ng/ml，較C組及S組均明顯升高(P=0.000)；A組濃度為(7.21±0.51)ng/ml，與膿毒癥組比較無(wú)顯著性差異(P=0.810)；B組cTnI濃度為(4.30±0.84)ng/ml，較C組及S組升高(P=0.000

12、)，明顯低于M組(P=0.000)。
　　 3.膿毒癥心肌TNF-α、ET-1水平變化及UTI的影響
　　 M組心肌勻漿TNF-α[(945.59±72.03)pg/g]、ET-1[(776.774±123.89)pg/g]水平較C組[(238.23±35.22)pg/g，(170.14±28.26)pg/g，P<0.01]及S組[(273.99±33.15)pg/g，(222.76±51.01)pg/g，P<0.01]

13、明顯升高(P<0.01)，A組TNF-α、ET-1水平[(910.46±96.64)pg/g，(714.04±66.74)pg/g]與M組比較無(wú)明顯下降(P>0.05)，而B(niǎo)組TNF-α、ET-1水平[(430.45±75.64)pg/g，(377.13±38.98)pg/g]明顯低于M組(P<0.01)，但仍高于C組及S組(P<0.01)。
　　 4.膿毒癥心肌p-p38MAPK、p38 MAPK改變及UTI的影響
　　

14、 M組p-p38/p38灰度比值為0.79±0.12，較C組(0.34±0.15)及S組(0.28±0.15)明顯升高(P=0.001)，A組(0.75±0.12)與M組比較無(wú)顯著性差異(P=0.682)，B組p-p38/p38灰度比值為(0.36±0.0.26)，明顯低于M組(P=0.001)，與C組及S組比較無(wú)明顯差異(P=0.635和0.972)。
　　 結(jié)論
　　 1.CLP后24h，膿毒癥大鼠心肌存在顯著病理

15、結(jié)構(gòu)損傷，伴血清cTnI明顯升高，表明該模型可用于心肌損傷的研究。TNF-α，及ET-1在膿毒癥大鼠心肌組織濃度明顯升高，二者可能與膿毒癥心肌損傷關(guān)系密切。p38MAPK作為炎癥通路的重要信號(hào)蛋白，在膿毒癥心肌中磷酸化水平明顯升高，說(shuō)明p38MAPK炎癥通路在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮了重要作用。
　　 2.小劑量UTI(5000U/Kg)對(duì)膿毒癥大鼠心肌結(jié)構(gòu)及血清cTnI的變化無(wú)顯著影響，而大劑量UTI(20000U/Kg)可以明顯