基于RARα靶點的維甲酸誘導細胞分化和凋亡作用機制研究.pdf

1、浙江大學藥學院博士學位論文基于RARα靶點的維甲酸誘導細胞分化和凋亡作用機制研究姓名：羅沛華申請學位級別：博士專業(yè)：藥物分析學指導教師：程翼宇楊波20090601化的相關基因轉錄和蛋白表達情況；應用細胞免疫熒光檢測MATl和CAK凡u№通路相關蛋白在分化各階段的表達；結合免疫沉淀檢測分化各個階段血細胞CAKRARtx通路蛋白之間相互作用的關系。3)選用人急性T淋巴Molt3細胞為研究對象，RA作用，采用臺盼蘭拒染法結合血細胞計數(shù)板計數(shù)，

2、觀察其對細胞增殖情況的影響；采用PI染色，流式細胞術分析細胞凋亡；應用Westernblot技術檢測細胞凋亡的相關蛋白easpase3、PARP、BCL2、BAX的表達；應用RTPCR和Westernblot技術檢測RARtz和p21的基因轉錄和蛋白表達研究結果：1)通過臺盼蘭拒染法和血細胞計數(shù)板計數(shù)，顯示ATRA(5pM)可顯著抑制U20S和MG63細胞增殖流式細胞術分析細胞周期情況，顯示ATRA(5“M)能使人骨肉瘤細胞的細胞周期阻

3、滯在G1／G0期同時，通過Westernblot技術檢測相關周期蛋白，發(fā)現(xiàn)ATRA(5laM)能降低U20S和MG63細胞中CDK7和p21的表達，引起P27的上調(diào)該濃度的ATRA也能誘導入骨肉瘤細胞分化標記物OPN的基因轉錄和蛋白表達增加，顯示ATRA可誘導骨肉瘤細胞分化。通過基因芯片比較ATRA誘導分化細胞與空白對照細胞的基因表達譜，推測ATRA誘導骨肉瘤分化可能與RARtz、RAR[3、BMP、WNT和FGF蛋白有關2)通過臺盼蘭

4、拒染法和血細胞計數(shù)板計數(shù)及吉姆薩染色顯示ATRA(1pM)能抑制分化各個階段造血干細胞HSC、CMP和GMP細胞的增殖，增加三者的粒性分化。通過免疫熒光和Westernblot技術確定了CAKRARO【通路上pRb、MATl，CDK7和RARRARaa在分化各個階段造血干細胞HSC、CMP和GMP細胞中的表達情況，從中顯示MATl的表達隨著粒性分化的成熟而降解，在HSC中表達最高、CMP次之，GMP最低。ATRA(1“M)誘導CMP細胞

5、粒性分化過程中，CDK7和RARa的表達增加，P21的表達下降，同時pRb，CDK7及№的磷酸化水平都發(fā)生下調(diào)。結合免疫沉淀技術還可見ATRA(1pM)促進的CMP和GMP細胞粒性分化時，可使CAKRAR0【復合體的解離，CMP細胞在粒性分化過程中還伴隨著RAR(I和CDK7表達的下調(diào)，GMP細胞則伴隨著MATl的降解3)通過慢病毒轉染法，血細胞計數(shù)板計數(shù)，RTPCR和WesternBlot顯示外源性低磷酸化的RAR(：t能顯著抑制人骨