基于磁性納米粒子及發(fā)光技術的銅綠假單胞菌高靈敏檢測及分型方法研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)是一種投機主義的革蘭氏陰性菌，易在免疫力低下個體中盛行，因此在醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染病例中許多是由P.aeruginosa引起的。P.aeruginosa是目前各種醫(yī)院內感染中最廣泛、最嚴重的問題之一，感染率居病原菌之首。由于P.aeruginosa在濃度很低的時候就能引起感染，因此早期檢測對于治療P.aeruginosa引起的感染至關重要。納米技術在過

2、去二十年取得了飛速的發(fā)展，由于其具有高表面積以及容易被外部磁場控制等特點，已經為快速自動化生物分子檢測開啟了一扇新的大門。本研究擬利用磁性納米技術建立易于實現(xiàn)自動化的P.aeruginosa高靈敏檢測及分型方法。具體研究內容如下。
　　1、超分散性磁性納米粒子(MNPs)的制備及表面修飾
　　由于MNPs在眾多領域的廣泛應用，合成不同類型的MNPs一直是研究的熱點。我們以PEG-4000為表面活性劑，通過高溫溶劑熱法制備了一

3、種高分散性的MNPs。研究結果表明，在最佳條件下合成的MNPs粒徑在350-450 nm之間，具有良好的分散性和非常窄的粒徑分布。沉降實驗顯示，合成的MNPs與商品化MNPs MP10101相比沉降時間大大增長，12小時后仍保持良好的分散性。為了獲得更加穩(wěn)定的功能化粒子，我們在MNPs表面進行了層層修飾，SEM、TEM及FTIR等分析表征手段證明得到的功能化MNPs具有良好的分散性及均一的形貌。元素分析及能量圖譜結果顯示MNPs@Pro

4、be表面P元素含量為0.33％。
　　2、建立了基于磁富集PCR及磁富集巢式PCR的P.aeruginosa高靈敏檢測方法
　　P.aeruginosa是一種臨床上常見的條件致病菌，也是威脅人類健康的主要因素之一。由于核酸自動化檢測發(fā)展的必然趨勢，近幾年來基于MNPs的基因組DNA分離和檢測技術得到了快速發(fā)展。本論文以P.aeruginosa特異性基因gyrB為研究對象，優(yōu)化并建立了一種磁富集PCR方法。在相同菌液濃度的條件

5、下，磁富集PCR與傳統(tǒng)PCR相比因具有更高的模板利用率，所以擴增效率更高。構建的檢測方法可以有效地檢測到100 cfu/mL的P.aeruginosa。在磁富集PCR的基礎上，進一步發(fā)展了ecfX基因的磁富集巢式PCR，建立了高特異性、高靈敏度的檢測方法。實驗結果表明該方法有良好的特異性和靈敏度，P.aeruginosa的最低檢出濃度為10cfu/mL。該方法不僅為P.aeruginosa高靈敏早期檢測提供了技術基礎，也縮短了從核酸抽提

6、到樣本檢測的時間和簡化了操作步驟，為實現(xiàn)快速自動化檢測提供了新的思路。
　　3、利用磁富集PCR、磁分離技術及化學發(fā)光技術構建了P.aeruginosa的超靈敏檢測方法
　　盡管磁富集巢式PCR方法可以實現(xiàn)P.aeruginosa高靈敏檢測，但是由于其難以實現(xiàn)自動化及定量檢測，在臨床檢驗受到了諸多限制。為此，基于磁富集PCR、磁分離及化學發(fā)光技術，建立了一種P.aeruginosa易于實現(xiàn)自動化的超靈敏定量檢測方法，并對該方

7、法進行了條件優(yōu)化。我們用該方法檢測了3株P.aeruginosa標準菌株(ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104)。結果顯示，樣本的化學發(fā)光強度與對照相比均具有顯著性差異且Q值大于2.1。靈敏度研究結果顯示，該方法能檢測到30 fM的PCR產物及10 cfu/mL的樣本。該方法對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌及金黃色葡萄球菌樣本檢測結果均為陰性，表明具有較高的特異性。
　　4、建立了基于磁富集多重PCR及化

8、學發(fā)光的P.aeruginosa T3SS基因分型方法
　　本研究利用磁富集多重PCR和化學發(fā)光技術建立了一種T3SS基因的快速分型方法。我們使用該方法對三個P.aeruginosa標準菌株ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104進行了分型驗證。結果表明，這三個菌株的T3SS基因中，exoT、 exoY、 exoS三個基因化學發(fā)光值都大于對照10倍以上，Q值也均大于2.1，三個標準株exoU的Q值均少于2.1。檢測

9、結果與電泳結果相符合，說明建立的方法是可靠的。利用該方法對22株臨床樣本進行了T3SS基因型的研究。結果表明，在22個臨床樣本中，100％的樣本中含有exoT基因，72.7％的樣本含有exoY基因，95.5％的樣本含有exoS基因，4.5％的樣本含有exoU基因，exoS與exoU基因不能同時存在于同一菌株中。臨床樣本分型的所有結果均與PCR分型結果一致。
　　5、結合磁富集及磁分離雙色熒光雜交技術建立了exoS基因SNP分型方法

10、
　　P.aeruginosa T3SS的exoU、exoS、exoT及exoY四個毒力基因都含有SNP位點。前面研究顯示22個臨床樣本中95.5％含有exoS。結合磁富集PCR、磁分離及雙色熒光雜交技術，建立了exoS基因G162A及G434C位點SNP分型方法，為了解P.aeruginosa T3SS基因型的變異提供了技術基礎。利用這個方法對三株標準菌株分別進行了這兩個位點的SNP分型研究。結果表明三個標準菌株的兩個SNP位點