糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　 TOLL樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)且備受關(guān)注的一種細(xì)胞跨膜受體及病原識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRR),在天然免疫中通過對(duì)病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的識(shí)別發(fā)揮作用,是天然免疫和獲得性免疫的橋梁。近期TLRs信號(hào)傳導(dǎo)途徑在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中

2、所起的作用成為研究的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病患者單核細(xì)胞中TLR2,TLR4的表達(dá)增加,肺泡巨噬細(xì)胞在清除吸入性抗原及致病微生物方面等都具有重要的作用,故本實(shí)驗(yàn)以肺泡巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象觀察TLR4在正常大鼠及糖尿病4周,8周大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的變化,探討糖尿病機(jī)體免疫防御能力變化的發(fā)生機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1、動(dòng)物模型制備及分組健康雄性Wistar大鼠24只,SPF級(jí),鼠齡12周,體重(200±20)克,購于中

3、國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(A組,n=8),糖尿病4周組(B組,n=8),糖尿病8周組(C組,n=8)。糖尿病組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg體重,對(duì)照組注射同等劑量枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液,72小時(shí)后隨機(jī)血糖≥16.67mmol/L,為復(fù)制糖尿病模型成功。
　　 2、肺泡巨噬細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)BALF離心后沉淀細(xì)胞加入含10％小牛血清、10萬單位/L青霉素、10萬單位/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液

4、,放入事先放有蓋玻片的60mm培養(yǎng)皿中,充分混勻后在37℃,5％CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí),使臣噬細(xì)胞貼壁,棄去非貼壁細(xì)胞。
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察TLR4在各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的變化將貼有巨噬細(xì)胞的蓋玻片用4％多聚甲醛固定30分鐘,PBS洗片后采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色SABC法染色。各組切片用Meta-Morph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽性細(xì)胞單位面積平均光密度值。
　　 4、統(tǒng)計(jì)分析

5、
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x)±s表示,各組間指標(biāo)比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果正常組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞可見弱的TLR4表達(dá),以胞漿及胞膜為主呈較淡的棕黃色改變;糖尿病4周組細(xì)胞TLR4在上述部位的表達(dá)增多,在胞漿及胞膜呈會(huì)黃色改變;糖尿病8周組細(xì)胞的胞漿及胞膜呈深棕黃色改變,部分細(xì)胞胞核形態(tài)不規(guī)則。