TLR4受體介導(dǎo)的殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞激活機(jī)制的研究.pdf

1、背景：殼寡糖（COS）是殼聚糖的降解產(chǎn)物，由于具有分子量小、沒有毒性、容易吸收以及水溶性好等特點(diǎn)，較殼聚糖能夠發(fā)揮更重要的生物學(xué)功能。殼寡糖在提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、促進(jìn)傷口愈合等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來殼寡糖在提高免疫力、抗腫瘤方面的研究受到很大關(guān)注。前期研究表明殼寡糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但是殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的機(jī)制尚未見詳細(xì)報(bào)道。
　　方法：本項(xiàng)目通過殼聚糖酶水解法水解殼聚糖制備

2、殼寡糖，高效液相色譜法（HPLC）對(duì)殼寡糖產(chǎn)物的成分進(jìn)行鑒定。在體外研究了不同濃度殼寡糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖、細(xì)胞吞噬中性紅能力以及分泌α-腫瘤壞死因子（TNF-α）能力的影響。對(duì)小鼠灌胃不同劑量的殼寡糖，在體內(nèi)研究了殼寡糖對(duì)小鼠血清中免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）含量以及小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響。用異硫氰酸酯熒光素（FITC）將殼寡糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，制備FITC-COS；以巨噬細(xì)胞系RAW264.7為對(duì)象，研究巨噬細(xì)胞

3、對(duì)殼寡糖的吞噬作用以及探究TLR4受體在吞噬過程中扮演的關(guān)鍵角色，研究殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO能力的影響以及TLR4受體沉默對(duì)巨噬細(xì)胞分泌功能的影響，初步比較殼寡糖混合物、殼五糖和殼六糖功能的異同，并用RT-PCR法檢測(cè)殼寡糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α，iNOS，TLR4等基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　結(jié)果：HPLC分析結(jié)果顯示殼聚糖酶水解法制備的殼寡糖主要為3~7單糖聚合度的寡糖。殼寡糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)功能：體外研究表明殼寡糖被

4、巨噬細(xì)胞吞噬后可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的增殖功能，刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α；體內(nèi)研究結(jié)果表明小鼠灌胃殼寡糖能夠顯著增加小鼠的脾臟指數(shù)，增加血清中IgG的含量，對(duì)胸腺指數(shù)和血清中IgM的含量沒有顯著影響。將FITC-COS作用于巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明巨噬細(xì)胞能夠吞噬殼寡糖，隨著時(shí)間的延長細(xì)胞吞噬殼寡糖的量不斷增加，在15min左右達(dá)到吞噬高峰；TLR4單克隆抗體預(yù)處理巨噬細(xì)胞1h后再加入FITC-COS，巨噬細(xì)胞對(duì)殼寡糖的

5、吞噬作用幾乎完全被抑制。殼寡糖能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，提高其吞噬中性紅的能力，以及分泌NO的能力，各類寡糖糖樣中以殼六糖的效果最好。TLR4單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞后再加入COS，RAW264.7細(xì)胞分泌NO的能力急劇降低。殼寡糖能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF，iNOS，TLR4等基因轉(zhuǎn)錄，但結(jié)果仍需進(jìn)一步探討。
　　結(jié)論：殼寡糖（3~7聚合度）能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞，具有較好的體外、體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能，殼寡糖對(duì)巨噬細(xì)