甘草中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的同時檢測方法及免疫親和柱的再利用研究.pdf

1、目的：建立同時檢測甘草中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的HPLC-FLD和LC-MS/MS測定方法；研究免疫親和柱再利用的可行性；運用再利用的免疫親和柱凈化17種中藥材，并用HPLC-FLD方法測定藥材中黃曲霉毒素與赭曲霉毒素A的含量。
　　方法：（1）甘草經(jīng)甲醇-水（80∶20）超聲提取20min后，用免疫親和柱凈化和富集；以甲醇和0.5％的乙酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用柱后在線光化學(xué)衍生，熒光檢測器測定。黃

2、曲霉毒素的檢測波長為激發(fā)波長λex=360nm，發(fā)射波長λem=440nm；赭曲霉毒素A的檢測波長為λex=333nm，發(fā)射波長λem=460nm。（2）甘草經(jīng)甲醇-水（體積比為80∶20）超聲提取后，AflaOchra HPLCTM免疫親和柱凈化和富集。以0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液為流動相,通過C18色譜柱梯度洗脫,采用電噴霧離子源,黃曲霉毒素采用正離子模式檢測，赭曲霉毒素A采用負(fù)離子模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。（3）采用甲醇

3、-水（80∶20）除去柱上吸附的雜質(zhì)和變性的抗體，再用水淋洗柱子，最后用PBS緩沖液作為再生液淋洗以及填充柱子。17種中藥材經(jīng)甲醇-水（80∶20）超聲提取后，用2%吐溫-20/PBS溶液進(jìn)行稀釋，過再生后的免疫親和柱，用水洗去雜質(zhì)，再用甲醇洗脫毒素；以甲醇和0.5%的乙酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，用光化學(xué)衍生，熒光檢測器測定。
　　結(jié)果：（1）本研究建立了免疫親和柱凈化-在線柱后光化學(xué)衍生HPLC-FLD同時測定甘草中黃曲霉毒

4、素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A含量的檢測方法。結(jié)果表明黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1和赭曲霉毒素A的檢測限分別為0.02、0.06、0.015、0.03、0.25μg/kg；黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1和赭曲霉毒素A分別在0.075~30.0ng/ml，0.25~100ng/ml，0.075~30.0ng/ml，0.25~100ng/ml，1.0~100ng/ml范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)大于0.999；平均加標(biāo)回收率為76.0

5、%~103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于12.7%。（2）建立了LC-MS/MS法同時測定甘草中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A含量的方法。結(jié)果表明黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1和赭曲霉毒素A的檢測限分別為0.005、0.003、0.005、0.007、0.003μg/kg；黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1和赭曲霉毒素A分別在0.015~6.0ng/ml，0.01~20ng/ml，0.015~6.0ng/ml，0.0

6、2~20ng/ml，0.01~20ng/ml范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)大于0.996；平均加標(biāo)回收率為72.7%~126.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于20%。（3）免疫親和柱的再生及重復(fù)使用研究結(jié)果表明，免疫親和柱經(jīng)再生后至少可重復(fù)利用一次，回收率達(dá)到檢測要求。采用再利用的免疫親和柱凈化并測定了17種中藥中的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的含量；經(jīng)用枸杞子、苦杏仁、干姜對該檢測方法進(jìn)行考察，結(jié)果顯示枸杞子的黃曲霉毒素與赭

7、曲霉毒素 A的平均加標(biāo)回收率為72.1%~105.7%，RSD低于13.3%；苦杏仁的黃曲霉毒素與赭曲霉毒素A的平均加標(biāo)回收率為76.5%~95.0%，RSD低于7.8%；干姜的黃曲霉毒素與赭曲霉毒素 A的平均加標(biāo)回收率為62.3%~98.0%，RSD低于11.5%，均符合美國官方分析化學(xué)師協(xié)會和歐盟的相關(guān)規(guī)定。
　　結(jié)論：本實驗建立的同時檢測甘草中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的HPLC-FLD和LC-MS/MS