靶向腫瘤的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒（mimoretrovirus）介導(dǎo)的針對(duì)人POKEMON基因的RNAi策略在宮頸癌基因治療中的作用研究.pdf

1、宮頸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于腫瘤疾病的本質(zhì)是“基因病”，宮頸癌也不例外，故從理論上講，從基因水平來(lái)解決癌癥問(wèn)題是最佳途徑。siRNA能夠高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)，已經(jīng)成為應(yīng)用于臨床疾病尤其是腫瘤防治研究的有力工具。但是，對(duì)于RNAi應(yīng)用到腫瘤的基因治療而言，涉及到靶基因的選擇和體內(nèi)遞送系統(tǒng)(宿主細(xì)胞的高效定向轉(zhuǎn)運(yùn))等非常關(guān)鍵的問(wèn)題。從目前國(guó)外文章報(bào)道情況來(lái)看，這些問(wèn)題并沒(méi)有很好地解決。所以，要解決用RNAi策略解決腫瘤的基因治

2、療問(wèn)題，必須綜合考慮這些問(wèn)題才能真正使之將來(lái)應(yīng)用于臨床。 在靶基因的選擇問(wèn)題上，由于腫瘤的發(fā)生涉及到體內(nèi)諸多重要分子，而且這些分子在體內(nèi)形成一個(gè)或多個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。有些分子可能是位于這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的中下游，是具體執(zhí)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化(transformation)或轉(zhuǎn)化之后的某些功能的分子。如果對(duì)這些分子進(jìn)行“基因沉默”，腫瘤細(xì)胞有可能通過(guò)其它支路或旁路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而達(dá)到細(xì)胞轉(zhuǎn)化的目的?；诖?，雖然我們目前還不知道這個(gè)網(wǎng)絡(luò)頂層的具體分子，但是如

3、果我們對(duì)目前已知的位于最頂層的重要分子進(jìn)行干預(yù)則應(yīng)該會(huì)取得更好的效果。所以在我們的實(shí)驗(yàn)中選擇了Pokemon原癌基因作為RNAi的靶標(biāo)。Pokemon(forPOKerythroidmyeloidontogenicfactor)，發(fā)現(xiàn)于2005年，其在細(xì)胞分化中具有多種非常關(guān)鍵的功能，并且同其它POK家族成員如BCL6有物理性接觸。已有的證據(jù)已經(jīng)證明了其是腫瘤發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。在人類(lèi)多種腫瘤中該基因異常高表達(dá)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其作用模式為

4、：Pokemon↑↑→ARF↓→MDM2→p53↓→腫瘤發(fā)生。所以，Pokemon的作用是位于許多腫瘤抑制基因和原癌基因的上游，故將其作為靶基因?qū)⒂兄趯?duì)腫瘤的根治。 第二個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是siRNAs的體內(nèi)定向遞送問(wèn)題。這也是制約RNAi技術(shù)在體內(nèi)應(yīng)用的瓶頸之一。由于Pokemon蛋白的作用與細(xì)胞的分化、腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，所以在正常組織中不可避免地或多或少地存在，如果對(duì)機(jī)體所有組織細(xì)胞的Pokemon基因表達(dá)進(jìn)行干擾可能會(huì)對(duì)正常組

5、織分化、發(fā)育等生理過(guò)程帶來(lái)負(fù)面影響。我們認(rèn)為通過(guò)siRNAs向腫瘤組織特異靶向遞送可以一方面避免這種負(fù)面影響，另一方面也可以有效地利用好有限的siRNAs資源，從而提高腫瘤基因治療的效率。選擇性地表達(dá)在腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織新生血管上的整合素αvβ3的三肽Arg-Gly-Asp(RGD)能夠把化學(xué)合成定向帶到腫瘤組織部位，并取得較好的腫瘤治療效果。但是化學(xué)合成siRNAs費(fèi)用昂貴，并且還有作用時(shí)間不會(huì)太長(zhǎng)(因?yàn)镽NA在體內(nèi)很容易被降解)和實(shí)

6、際操作困難的問(wèn)題(因?yàn)镽NA水平的操作遠(yuǎn)較DNA水平操作麻煩)。并不適用于腫瘤防治這樣一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)可以解決這個(gè)問(wèn)題。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以將其基因組插入到腫瘤細(xì)胞基因組中，并將從此長(zhǎng)期存在，其效應(yīng)也會(huì)與其相伴隨。這也是逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在RNAi領(lǐng)域和腫瘤治療研究領(lǐng)域倍受關(guān)注的原因。但是，同其它病毒一樣，逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備過(guò)程仍很復(fù)雜，并且制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度仍是困擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的關(guān)鍵因素，并且它也沒(méi)有組織靶向性。另外，由于病毒的成分復(fù)

7、雜，其實(shí)際臨床應(yīng)用時(shí)將面臨諸多疑問(wèn)。 基于此，我們將上述幾種設(shè)想進(jìn)行了整合，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)： (一)針對(duì)Pokemon基因的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定首先從Genebank中獲取Pokemon原癌基因mRNA序列全長(zhǎng)，通過(guò)Ambion公司在線(xiàn)設(shè)計(jì)工具，設(shè)計(jì)了4對(duì)針對(duì)Pokemon的siRNA序列，并將其分別定向克隆入pSilencer5.1-H1Retro逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，并且將表達(dá)載體的線(xiàn)性載體的粘

8、性末端用Klenow酶補(bǔ)平后，再連接起來(lái)構(gòu)建了空載體對(duì)照質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)雙酶切、及測(cè)序鑒定，確定了所構(gòu)建的重組PokemonsiRNAs表達(dá)質(zhì)粒及空載體對(duì)照質(zhì)粒是完全成功的。 (二)各重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒對(duì)Pokemon基因沉默效應(yīng)的檢測(cè)及其對(duì)Hela細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變?nèi)缓螅瑢⑺鶚?gòu)建的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4個(gè)編碼不同siRNA序列重組質(zhì)粒及空載體對(duì)照質(zhì)粒的Hela細(xì)胞。經(jīng)過(guò)Q-PCR以及WB檢測(cè)

9、，觀(guān)察了轉(zhuǎn)染不同siRNA表達(dá)質(zhì)粒后，Hela細(xì)胞中Pokemon基因的表達(dá)情況。并且應(yīng)用MTT、凋亡關(guān)鍵酶Capase3/7活性檢測(cè)、以及transwell侵襲性檢測(cè)等方法，檢測(cè)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，Hela細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了Q-PCR及WB的結(jié)果，篩選出沉默效應(yīng)最好的siRNA序列。Q-PCR及WB結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組Hela細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染編碼GTCCTCGTCCTTAAAGTGC的HpsiRNA-4的Hela細(xì)胞中

10、，Pokemon基因表達(dá)下降了83％，同時(shí)對(duì)其增殖速率、以及侵襲性等生物學(xué)性狀的觀(guān)察也發(fā)現(xiàn)，其增殖速度為未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的65％，侵襲性減弱為30％，其凋亡關(guān)鍵酶活性則上升為未轉(zhuǎn)染組的2.2倍。從上述結(jié)論看來(lái)，通過(guò)對(duì)Hela細(xì)胞中Pokemon基因的沉默，可以促使Hela細(xì)胞的表型呈良性轉(zhuǎn)變，為后期的在體腫瘤預(yù)防性實(shí)驗(yàn)和治療性實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 (三)針對(duì)POKEMON基因的siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒及其模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備為了嘗

11、試解決siRNAs體內(nèi)定向遞送的問(wèn)題，我們利用本教研室已經(jīng)研制的富含正電荷的mimovirus多聚賴(lài)氨酸系統(tǒng)，它可以通過(guò)電荷間的相互作用與帶負(fù)電荷的DNA自組裝形成納米級(jí)病毒樣顆粒。并將靶向腫瘤及腫瘤新生血管的三肽Arg-Gly-Asp(RGD)整合其中，設(shè)計(jì)了momiretrovirus的多肽包裝系統(tǒng)，在RGD肽與多聚賴(lài)氨酸的連接方式上采用了直接連接和柔性L(fǎng)inker連接兩種方式，其序列為KKKKKKKKKKKKKKKKKK-ACRG

12、DMFGCA(直接連接)和KKKKKKKKKKKKKKKKKK{acp}S{acp}S{acp}SACRGDMFGCA(柔性L(fǎng)inker連接)，上述多肽包裝系統(tǒng)在HBS緩沖液中與重組質(zhì)?？梢宰越M裝形成了20nm大小的病毒樣顆粒，我們通過(guò)了不同電荷比情況下，靶向腫瘤的多聚賴(lài)氨酸系統(tǒng)對(duì)重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒的包被情況以及所形成的病毒樣顆粒的大小。并且通過(guò)DNaseⅠ保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了我們所設(shè)計(jì)的靶向腫瘤的多聚賴(lài)氨酸系統(tǒng)對(duì)核酸酶的抵抗作用。在體外

13、實(shí)驗(yàn)中，初步證實(shí)了這一系統(tǒng)可以通過(guò)系統(tǒng)給藥來(lái)完成對(duì)siRNA表達(dá)質(zhì)粒的遞送。為了觀(guān)察我們所設(shè)計(jì)的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)Pokemon基因的沉默作用，我們用不同的電荷比所制備的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒包括2種靶向腫瘤的模擬病毒(K18+RGD，K18+Linker+RGD)以及單純多聚賴(lài)氨酸(K18)所制備的非靶向的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒，在體外分別感染Hela細(xì)胞，并通過(guò)Q-PCR檢測(cè)了Hela細(xì)胞被感染后，其Pokemon基因的表達(dá)水平。作為對(duì)照，我們還觀(guān)察

14、了用滴度為105CFU/ml感染的Hela細(xì)胞以及把200ngsiRNA表達(dá)質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑直接轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，Pokemon基因的表達(dá)變化。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)以及結(jié)果顯示，當(dāng)電荷比達(dá)到2以上時(shí)，質(zhì)粒所帶的負(fù)電荷被完全中和，同時(shí)透射電鏡觀(guān)察也顯示只有當(dāng)電荷比達(dá)到2以上時(shí)，多肽包裝系統(tǒng)才能與質(zhì)粒自組裝形成完整的病毒樣顆粒。DNaseⅠ保護(hù)性實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了，只有在此電荷比以上時(shí)，多肽包裝系統(tǒng)才能對(duì)質(zhì)粒起到完全的保護(hù)作用。Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，K

15、18+RGD，K18+Linker+RGD及K18對(duì)照組模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒的沉默效應(yīng)無(wú)顯著差異，均在電荷比為4時(shí)的沉默效應(yīng)最強(qiáng)，在此比例下感染Hela細(xì)胞，其Pokemorl基因的表達(dá)均相當(dāng)與正常Hela細(xì)胞下降了43％，而逆轉(zhuǎn)錄病毒感染組下降了約50％左右。 (四)模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒抗腫瘤效應(yīng)的在體研究最后，為觀(guān)察靶向腫瘤的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒在活體內(nèi)的作用，我們?cè)赟CID小鼠的腹股溝區(qū)皮下接種1×107個(gè)Hela細(xì)胞建立了移殖瘤模型，進(jìn)行

16、了預(yù)防性實(shí)驗(yàn)和治療性實(shí)驗(yàn)。在預(yù)防性實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)诮臃NHela細(xì)胞的同時(shí)，就通過(guò)小鼠尾靜脈注射了相當(dāng)于4pmol重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒，此后每5天注射一次，并觀(guān)察我們所制備的模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒預(yù)防腫瘤生成的作用。在治療性實(shí)驗(yàn)中，則將首次注射時(shí)間改在接種后12d，腫瘤直徑為5mm左右時(shí)。預(yù)防性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種Hela細(xì)胞3周后，注射靶向腫瘤的2種模擬病毒的10只小鼠均無(wú)腫瘤生成，在K18對(duì)照組也僅有2只小鼠生成腫瘤，而空白對(duì)照

17、組及空載對(duì)照組的各5只小鼠均在12d左右就有可觸及的腫瘤生成。在治療性實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)4次注射后，在K18+RGD，K18+Linker+RGD實(shí)驗(yàn)組以及K18對(duì)照組中，腫瘤生長(zhǎng)均明顯受到抑制，腫瘤體積明顯小于空白對(duì)照及空載對(duì)照組。在這些實(shí)驗(yàn)組中，K18+Linker+RGD組的效果最好。 綜上所述，本研究構(gòu)建了針對(duì)Pokemon癌基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并且證實(shí)了通過(guò)下調(diào)Pokemon基因的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，可以