逆轉(zhuǎn)錄病毒介導GW112基因在胃癌SGC-7901細胞中的表達研究.pdf

1、胃癌(Gastric Cancer,GC),目前第四大惡性腫瘤,是目前腫瘤死亡的第二位。盡管近年來在手術(shù)、放療、化療等方面已取得很大進展,但其療效仍不容樂觀,探索新的治療方法因而顯得十分迫切和必要。
　　 GW112,又名hGC-1,OLM4,hO1fD,屬嗅覺介導素(olfactomedin)相關(guān)的糖蛋白,與其他基因較少同源,結(jié)構(gòu)與功能所知甚少。其中以在胃癌的表達最為特異,屬胃癌高特異性表達基因之一。最新研究表明GW112可向

2、胞外分泌性表達,與細胞外黏附分子Lectins、Cadherin相互作用,有助于細胞黏附,據(jù)推測此特性與胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。GW112還可促腫瘤細胞生長,拮抗干擾素β與RA聯(lián)合誘導的細胞凋亡,并可與凋亡誘導分子GRIM-19發(fā)生蛋白間的相互作用并減弱其介導相關(guān)凋亡基因的表達。由于GW112在胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用及抗*凋亡機制尚未明確,有必要對其功能做進一步解析。
　　 然而,目前很少有研究調(diào)查GW112基因表達在胃癌中的作

3、用。有必要進一步研究GW112胃癌中的功能。本課題利用熒光定量PCR技術(shù),分析GW112基因在胃癌組織、癌旁組織以及正常胃粘膜組織中的表達差異。其次,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL,EGFP-N1系統(tǒng),構(gòu)建人GW112基因增強型表達載體pLEGFP-N1-GW112,并將其包轉(zhuǎn)出逆轉(zhuǎn)錄病毒,構(gòu)建GW112基因在胃癌細胞穩(wěn)定過表達的細胞模型,為深入了解GW112在胃癌中的作用及抗凋亡機制,奠定基礎(chǔ)。
　　 本課題實驗內(nèi)容與結(jié)果包括以下幾個

4、方面:
　　 1、分析比較GW112基因在胃癌組織、癌旁組織以及正常胃粘膜組織中的表達差異。
　　 收集23例胃癌組織、癌旁組織以及正常胃粘膜組織,抽提總RNA,設(shè)計合成GW112與β-actin的特異引物,利用實時定量PCR分析三者間GW112基因的表達差異。結(jié)果顯示:與癌旁組織以及正常胃粘膜組織相比,GW112基因在胃癌組織明顯上調(diào)(3-6倍);而癌旁組織以及正常胃粘膜組織相比無較大差異(1.3倍);研究顯示GW11

5、2基因在胃癌組織屬過表達,與國外研究基本一致。
　　 2、建立GW112穩(wěn)定過表達的SGC-7901細胞模型。
　　 構(gòu)建pLEGFP-N1-GW112重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,轉(zhuǎn)染PT67包裝細胞進行病毒包裝。經(jīng)G418篩選,建立穩(wěn)定的產(chǎn)毒的PT67-GFP與PT67-GW112細胞。收集病毒經(jīng)純化感染SGC-7901細胞,再次經(jīng)過G418篩選穩(wěn)定篩選,建立起SGC-7901-GFP對照細胞以及GW112穩(wěn)定過表達的SGC-

6、7901-GW112細胞株。實時定量PCR用于分析GW112基因的表達。
　　 1)、PCR擴增攜帶信號肽序列的GW112基因,擴增產(chǎn)物經(jīng)限制酶消化克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1的SalI與BamHI位點間,構(gòu)建pLEGFP-N1-GW112重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。酶切與測序結(jié)果分析顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確,且GW112基因與基因庫中NM.006418序列一致。
　　 2)、pLEGFP-N1-GW112與pLEGFP-

7、N1對照經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000.轉(zhuǎn)染如PT67包裝細胞,經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定產(chǎn)毒株P(guān)T67-GFP及PT67-GW112。
　　 3)、裂解后產(chǎn)生的病毒感染SGC-7901細胞,再次經(jīng)G418篩選,獲得了SGC-7901-GFP與SGC-7901-GW112的穩(wěn)定克隆。實時定量PCR檢測穩(wěn)定克隆間GW112基因表達水平。結(jié)果顯示:逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的GW112基因能穩(wěn)定而持久的增強GW112基因在胃癌SGC-